Expresión Génica y Dinámica de Metilación del ADN en Procesos de Organogénesis Adventicia

162 Pages·2013·6.48 MB·Spanish

UNIVERSIDAD DE OVIEDO
Departamento de Biología de Organismos y Sistemas

Programa de Doctorado: “Biología aplicada a la sostenibilidad de recursos
naturales (Mención de calidad)”

“Expresión Génica y Dinámica de Metilación del ADN en Procesos de
Organogénesis Adventicia en Pinus radiata D. Don”

“Gene Expression and DNA Methylation Dynamics in Adventitious
Organogenesis Processes in Pinus radiata D. Don”

TESIS DOCTORAL

José Luis Rodríguez Lorenzo
Oviedo 2013

RESUMEN DEL CONTENIDO DE TESIS DOCTORAL

1.- Título de la Tesis
Español/Otro Idioma: Expresión Génica y Inglés: Gene Expression and DNA
Dinámica de Metilación del ADN en Procesos Methylation Dynamics in Adventitious
de Organogénesis Adventicia en Pinus radiata Organogenesis Processes in Pinus radiata D.
D. Don Don

RESUMEN (en español)

Las coníferas representan más del 50 % de la masa forestal del planeta y debido
S a que los bosques juegan un papel crucial en el cambio climático, la multiplicación de
I
B
-
0 genotipos élite a través del cultivo in vitro se considera la técnica más eficaz. Estas
1
0
-
A
O técnicas son una posible fuente de variación epigenética que regula selectivamente la
V
-
T
A activación o inactivación de la expresión génica, y la metilación del ADN se encuentra
M
-
R
entre los diferentes mecanismos epigenéticos existentes.
O
F
Teniendo en cuenta estos antecedentes, en este estudio se aborda la regulación
epigenética de la organogénesis adventicia inducida por la citoquinina bencil adenina
(BA) en embriones zigóticos de Pinus radiata. El papel de la metilación del ADN y la
acetilación de la histona H4 como reguladores de la organogénesis adventicia se
comparó con otros programas de desarrollo como la rizogénesis adventicia o la
formación de callo inducida por auxinas y la inhibición de la germinación por el ácido
abscísico. Se evaluaron los niveles de 5-metil citosina global y la cantidad de Histona
H4 acetilada y su distribución espacio-temporal mediante inmunolocalización. Se
encontraron diferencias en las dos marcas epigenéticas en los embriones cultivados con
auxinas y BA a lo largo del tiempo debido a un desarrollo diferencial inducido por los
reguladores del crecimiento. En cuanto a la distribución de estas marcas en el tejido, los
embriones cultivados en BA tienen una metilación uniforme en todo el embrión que va
descendiendo según aumenta la acetilación de H4, especialmente en las nuevas yemas
en formación. En los embriones cultivados con auxinas se observan cambios muy
drásticos en las marcas epigenéticas de los meristemos radicular y caulinar, regiones
muy sensibles a la señalización por reguladores del crecimiento.
El análisis de la expresión diferencial de genes relacionados con la caulogénesis
nos permitió observar una inducción de las funciones relacionadas con el metabolismo,
encontrando diferentes genes inducidos y relacionados con estas funciones como
RuBIsCO, LTP1 y α-tubulina 1, así como otros genes relacionados con la fase de
adquisición de competencia y fotomorfogénesis inducida por este regulador del
crecimiento. Debido al importante papel en la transmisión de señal de mecanismos de
defensa y senescencia asociados a las citoquininas, varios genes relacionados con estrés
tenían una expresión inducida en embriones cultivados en ABA, pero estaban
reprimidos en BA.
Por último se constató una regulación mediante metilación del ADN en los
genes identificados como diferenciales mediante un desenmascaramiento químico en
cultivos celulares con 5-Aza-2-deoxicitidina mediante una inmunoprecipitación de
ADN metilado (MeDIP). Así mismo se identificaron nuevos genes candidatos mediante
la hibridación de un dot blot en esta misma situación experimental. Los resultados
obtenidos mostraron la inducción de 25S ARNr y ERD15, secuencias relacionadas con
la transducción de señal hormonal frente a estímulos externos, en el tratamiento con el
agente demetilante. El enriquecimiento diferencial de las secuencias metiladas a través
de MeDIP nos permitió identificar nuevas secuencias reguladas por metilación como un
transposon y varios genes relacionados con estrés como LTP-1, PR-10 y XB3. En los
cultivos celulares utilizados como control se identificaron dos grupos principales de
genes de acuerdo a su función biológica y un gen relacionado con desarrollo del
meristemo como es PROGRAMA DEL MERISTEMO ALTERADO 1 (AMP1) que regula
la formación del embrión en Arabidopsis. El primer grupo está relacionado con estrés
en el retículo endoplasmático, cuya represión podría tener su significado con la
inducción de ERD15 en el tratamiento con 5-Aza-2-deoxicitidina. El segundo grupo se
compone de genes relacionados con fotosíntesis y transporte de electrones los cuales
son reprimidos por 5-Aza-2-deoxicitidina probablemente debido a su posible acción en
los genes nucleares del cloroplasto.

RESUMEN (en Inglés)

Conifers represent more than 50% of mass forest on the planet and because
forests play a crucial role in climate change, the multiplication of elite genotypes by in
vitro culture are considered the most effective techniques. These techniques are
considered to be a possible source of epigenetic variation that selectively regulates
epigenetic activation or inactivation of gene expression, and DNA methylation is among
the existing different epigenetic mechanisms.
Keeping in mind this background, this study addresses epigenetic regulation of
adventitious organogenesis induced by cytokinin benzyl adenine (BA) in Pinus radiata
zygotic embryos. The role of DNA methylation and acetylation of histone H4 as
regulators of adventitious caulogenesis was compared to other developmental programs
such as auxin-induced adventitious rooting and callus formation, and inhibition of
germination by abscisic acid. The levels of global 5-methyl cytosine, and the amount of
acetylated histone H4 and their spatio-temporal distribution by immunolocalization
were assessed. Several differences were found in both epigenetic marks on embryos
cultured with auxin and BA along time due to differential development induced by
growth regulators. Regarding the distribution of these marks in the tissue, embryos
cultured with BA showed a uniform methylation throughout the embryo that decreases
at the same time that H4 acetylation show up, especially in new-formed buds. Those
embryos cultured with auxins had differences mainly in root and shoot meristems
whose cells are highly methylated in normal development but they are very sensitive to
growth regulators.
A later expression analysis of different genes involved in caulogenesis allowed
us to observe an induction of metabolism-related functions, finding different genes
related to these functions such as RuBIsCO, LTP1 1 and α-tubulin, and other genes
related to acquisition of competence and photomorphogenesis induced by this growth
regulator. Because of the important role in defense and senescence signal transduction
associated to cytokinins, several stress-related genes were induced in ABA cultured
embryos, but they were repressed in BA.
Finally, it was found a regulation by DNA methylation in the genes previously
identified as differential by chemical unmasking in cell cultures in the presence of
demethylating agent 5-Aza-2-deoxycytidine by methylated DNA immunoprecipitation
(MeDIP). In the same way candidate genes were identified by dot blot hybridization in
the same experimental situation. The results showed the induction of 25S rRNA and
ERD15, sequences related to hormonal signal transduction of external stimuli, in the
treatment with the demethylating agent. Differential enrichment of methylated DNA
assessed by MeDIP revealed new sequences like a transposon and various stress-related
genes such as LTP-1, PR-10 and XB3 as regulated by methylation. In control cell
cultures two main groups of genes, according to their biological function, and a gene
related to meristem development and organ formation patterns like AMP1 that regulates
embryo formation in Arabidopsis were identified. The first group related to stress in the
endoplasmic reticulum and their downregulation could be connected to ERD15
induction in 5-Aza-2-deoxycytidine mitigating the stress situation. The second group
related to photosynthesis and electron transport both of them repressed by of 5-Aza-2-
deoxycytidine because of its action in nuclear genes of the chloroplast.

Esta Tesis ha sido realizada en:
Universidad de Oviedo
Departamento de Biología de Organismo y Sistemas
Área de Fisiología Vegetal
Instituto Universitario de Biotecnología de
Asturias
Con la siguiente financiación:
Beca para la Formación de Personal Investigador:
BES-2005-7807
Proyecto AGL-2004-00810:
Impacto de la maduración-envejecimiento en la clonación de especies
agroforestales: Sistemas de multiplicación, competencia-expresión de genes
candidatos y validación de los regenerantes
Proyecto AGL2007-62907:
Código epigenético y regulación de subproteomas durante el envejecimiento-
revigorización de especies agroforestales
Fondo Social Europeo

Fondo Europeo de Desarrollo Regional