Exome-matching of dietary amino acids in flies and mice Inaugural-Dissertation zur Erlangung des ...

209 Pages·2017·30.82 MB·English

Exome-matching of dietary amino acids in flies and mice

Inaugural-Dissertation
zur
Erlangung des Doktorgrades
der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät
der Universität zu Köln
vorgelegt von

Georgios Soultoukis
aus Larisa, Griechenland

Köln, 2016
Berichterstatter: Prof. Dr. Linda Partridge
Prof. Dr. Mirka Uhlirova

Tag der mündlichen Prüfung: 03/06/2016

2
Exome-matching of dietary amino acids in flies and mice

PhD Thesis
Submitted by George A. Soultoukis
Supervisor: Professor Linda Partridge
Graduate School for Biological Sciences, University of Cologne

DEPARTMENT PARTRIDGE - BIOLOGICAL MECHANISMS OF AGEING

GRADUATE SCHOOL
FOR BIOLOGICAL SCIENCES
UNIVERSITY OF COLOGNE

3
See dying vegetables life sustain,
See life dissolving vegetate again:
All forms that perish other forms supply,
(By turns we catch the vital breath, and die),
Like bubbles on the sea of matter born,
They rise, they break, and to that sea return.

Alexander Pope, An Essay on Man (1733-34), Epistle III, lines 15-25

Molecular illusion, going on to confuse our minds…
…There reality is grey, with no hope or faith
I start a journey to inside, waking my first term
I'm just returning to my dream, where I'm coming from

Eloy – Inside (1974)

4
Declaration

I declare that the work presented in this thesis is my own except where duly noted.

George A. Soultoukis

22.02.16

5
Abstract

Dietary restriction (DR) is a moderate reduction in nutrient intake that
improves health and prolongs longevity across most species tested. The
restriction of specific nutrients, rather than overall food intake, is particularly
important in mediating the beneficial effects of DR. In flies dietary protein
mediates DR-induced lifespan-extension, and imbalance of single amino
acids (AAs) dictates longevity and fecundity. In a conserved fashion in mice
and rats, restriction of protein or of single essential AAs (EAAs) also extends
lifespan. However, the definition of what constitutes a limitation or excess in
the intake of an AA can be dubious as many past attempts to determine a
reliable measure for dietary AA requirements have had limited success. A
possible general predictor of the AA requirement of an organism could be its
genome, potentially allowing a rational design for a balanced dietary AA ratio.
Here it is reported that the exome composition of an organism may provide a
suitable template for its AA requirements. Matching the dietary AA supply of
flies or mice to their exome promotes anabolic traits including growth and
fecundity compared to amino acid profiles found in commonly used protein
sources including yeast and casein. In flies, the presence of exome-defined
limiting amino acids lowers the amount of bioavailable protein in the diet.
However this response also depended on the identity of the limiting amino
acid. Therefore the amino acid profile of a food source is an important factor
when considering the usage of dietary nitrogen, anabolic traits, and lifespan.

6
Zusammenfassung

Eine reduzierte Nahrungsaufnahme (dietary restriction, DR) verbessert die
Gesundheit und erhöht die Lebensdauer der meisten untersuchten Spezies.
Dabei ist die Verminderung spezifischer Nährstoffe, und nicht die reduzierte
Nahrungsaufnahme wesentlich für die positiven Effekte von DR. In Fliegen ist
der Proteinanteil der Nahrung für die DR-induzierte Verlängerung der
Lebensspanne verantwortlich; ein Ungleichgewicht von einzelnen
Aminosäuren bestimmt die Lebensdauer sowie Fertilität. In den
Säugetiermodellen Maus und Ratte verlängert eine verminderte Aufnahme
von Proteinen oder einzelnen essentiellen Aminosäuren ebenfalls die
Lebensspanne. Jedoch ist immer noch unklar, was eine Limitierung oder ein
Übermaß bei der Aufnahme von Aminosäuren darstellt, da frühere Versuche,
ein verlässliches Maß für die erforderliche Menge an Aminosäuren zu finden,
nicht besonders erfolgreich waren. Eine mögliche generelle Vorhersage des
Aminosäurebedarfs eines Organismus könnte sich aus seinem Genom
ergeben, das potentiell ein sinnvolles Design einer Diät mit einem
ausgewogenen Aminosäurverhältnis erlauben könnte. In der vorliegenden
Arbeit wird gezeigt, dass die Zusammensetzung des Exoms eines
Organismus eine brauchbare Vorlage für die Berechnung des
Aminosäurebedarfs des Organismus darstellt. Die Anpassung der
Aminosäurezusammensetzung der Nahrung an das Exom von Fliegen und
Mäusen begünstigt anabole Prozesse wie Wachstum und Fertilität im
Vergleich zur Aminosäurezusammensetzung von herkömmlichen
Proteinquellen für Nahrung wie Hefe oder Kasein. In Fliegen reduziert eine
durch das Exom definierte limitierende Aminosäure die Menge des
bioverfügbaren Proteins im Futter. Jedoch ist diese Reaktion auch von der Art
der limitierenden Aminosäure abhängig. Deshalb ist die
Aminosäurezusammensetzung der Nahrungsquelle ein wichtiger Faktor bei
der Untersuchung der Lebensspanne, anaboler Prozesse oder der Nutzung
des Stickstoffes der Nahrung.

7
Contents

DECLARATION 5
ABSTRACT 6
ZUSAMMENFASSUNG 7
CONTENTS 8
ACKNOWLEDGEMENTS 13
ABBREVIATIONS-ACRONYMS 15
PUBLICATIONS ARISING FROM THIS THESIS 16
CHAPTER 1. INTRODUCTION: PROTEIN, METABOLISM, AND AGEING 17
1.1 ABSTRACT 17
1.2 INTRODUCTION 18
1.2.1 DIET AND HEALTH 18
1.2.2 DIETARY RESTRICTION 18
1.2.3 DIETARY PROTEIN AND AMINO ACIDS 18
1.3 DIETARY RESTRICTION, HEALTH, AND AGEING 19
1.3.1 PROTECTIVE EFFECTS OF DIETARY RESTRICTION 19
1.3.2 PROTEIN CONTENT AND AA IMBALANCE 20
1.3.3 MULTIVARIATE COMPLEXITY OF DEFINING A DIETARY AA-IMBALANCE 20
1.3.4 ANABOLIC TRAITS AND THEIR EXPERIMENTAL ASSESSMENT 21
1.3.5 LINK BETWEEN ANABOLIC TRAITS AND LONG-TERM HEALTH? 21
1.4 AMINO ACIDS: INGESTION, ABSORPTION, AND SYSTEMIC AVAILABILITY 22
1.4.1 DIETARY PROTEIN AND AMINO ACID ABSORPTION 22
1.4.2 DIETARY AAS AND THE MICROBIOTA 23
1.4.3 THE SPLANCHNIC BED AND SYSTEMIC AA AVAILABILITY 24
1.4.4 METABOLIC FATE OF INGESTED AMINO ACIDS 25
1.5 DETECTION OF AA LIMITATIONS AND REGULATION OF METABOLISM AND HEALTH 27
1.5.1 GCN2-DEPENDENT DETECTION OF AA LIMITATION 27
1.5.2 GCN2-INDEPENDENT DETECTION OF AA LIMITATION 29
1.5.3 EFFECTS OF AA LIMITATIONS ON AGEING 30
1.5.4 TOR-DEPENDENT DETECTION OF AA ABUNDANCE 32
8
1.5.5 TOR-INDEPENDENT DETECTION OF AA ABUNDANCE 33
1.5.6 RESPONSES TO AA SURPLUSES THAT AFFECT PHYSIOLOGY AND AGEING 35
1.5.7 CONVERGENCE OF AA SENSING PATHWAYS 35
1.5.8 FOOD AVERSION, PROTEIN LEVERAGE, AND GROWTH SIGNALING 36
1.5.9 DISTINCT BIOENERGETIC AND METABOLIC ROLES OF AMINO ACIDS 37
1.5.10 HEALTH BIOMARKERS OF SPECIFIC AA-IMBALANCES 37
1.6 OPTIMAL AMINO ACID INTAKE 43
1.6.1 VARIATION IN REQUIREMENT FOR AMINO ACIDS. 43
1.7 CONCLUSIONS 45
1.8 OUTSTANDING QUESTIONS ADDRESSED IN THE CURRENT THESIS 45
1.9 SUMMARY POINTS LIST 46
CHAPTER 2: MATERIALS AND METHODS 48
2.1 MATERIALS AND METHODS FOR FLY EXPERIMENTS 48
2.1.1 MEDIA AND FLIES 48
2.1.2 AA RATIO CALCULATIONS AND DIET DESIGN 48
2.1.3 SILAC PROTEOME AMINO ACID USAGE 49
2.1.4 MEASURING DEVELOPMENT, BODY MASS, EGG LAYING AND LIFESPAN. 50
2.1.5 FLY TISSUE DISSECTION 50
2.1.6 FLY PROTEIN EXTRACTION 51
2.1.7 BCA PROTEIN ASSAY 51
2.1.8 WESTERN BLOT 51
2.1.9 PROBOSCIS EXTENSION BEHAVIOUR (PEB) 52
2.1.10 BLUE DYE ASSAY 52
2.1.11 DIETARY PREFERENCE ASSAY 52
2.1.12 TRIACYLGLYCERIDE 53
2.1.13 S35-LABELLED METHIONINE INCORPORATION ASSAY 53
2.1.14 PROTEOTOXIC STRESS ASSAY 53
2.1.15 MITOCHONDRIAL RESPIRATION 54
2.1.16 POLYRIBOSOME PROFILING 54
2.1.17 PROTEASOME ACTIVITY ASSAY 54
2.1.18 URIC ACID QUANTIFICATION 55
2.1.19 STATISTICAL ANALYSES 55
2.1.20 REPRODUCIBILITY AND EXPERIMENTAL DESIGN 55
2.2 MATERIALS AND METHODS FOR MOUSE EXPERIMENTS 56
2.2.1 MOUSE STRAIN SELECTION 56
2.2.2 MOUSE HOUSING 56
9
2.2.3 MOUSE FOOD AND WATER INTAKE 56
2.2.4 MOUSE DIET DESIGN 57
2.2.5 BODY MASS 57
2.2.6 MOUSE SILAC AMINO ACID USAGE 57
2.2.7 FOOD INDICES 57
2.2.8 PROTEIN EXTRACTION 58
2.2.9 PROTEIN AND DNA EXTRACTION FROM THE SAME SAMPLES 58
2.2.10 METABOLIC RATE, ENERGY EXPENDITURE, AND ACTIVITY 58
2.2.11 BLOOD METABOLIC PROFILE 58
2.2.12 GLUCOSE TOLERANCE TEST 59
2.2.13 INSULIN TOLERANCE TEST 59
2.2.14 FAT CONTENT CHARACTERISATION 59
2.2.15 UREA EXCRETION AND NITROGEN BALANCE 59
2.2.16 ORGAN MASS AND TISSUE HARVEST 60
2.2.17 CHARACTERISATION OF SKELETAL GROWTH AND BONE MINERAL PARAMETERS BY
µCT 60
2.2.18 HISTOPATHOLOGY 61
2.2.19 PORTAL VEIN PLASMA METABOLOMICS ANALYSIS 61
2.2.20 POWER ANALYSIS 61
CHAPTER 3: EXOME-MATCHING PREDICTS THE LIMITING EAA IN FLIES AND
MICE 64
3.1 ABSTRACT 64
3.2 INTRODUCTION 65
3.3 RESULTS 66
3.3.1 EXOME-MATCHING PREDICTS THE LIMITING AA FOR DROSOPHILA FECUNDITY 66
3.3.2 EXOME-MATCHING PREDICTS THE LIMITING AA FOR MOUSE GROWTH 71
3.3.5 INDIVIDUAL EXONS AND THEIR DISSIMILARITY TO THE MEAN EXOME AA USAGE 74
3.4 DISCUSSION 75
CHAPTER 4: EXOME-MATCHING OF ESSENTIAL AMINO ACIDS IN THE FLY
DIET MAXIMIZES ANABOLIC TRAITS 77
4.1 ABSTRACT 77
4.2 INTRODUCTION 78
4.3 RESULTS 79
4.3.1 FECUNDITY PREDICTIONS 79
4.3.2 AMINO ACID SENSING AND PERCEPTION 88
10