Table Of ContentEvolutionaryMethodsinBiotechnology
EditedbySusanneBrakmannandAndreasSchwienhorst
Further Titles of Interest
G. Kahl
The Dictionary of Gene Technology
3rd edition 2004, ISBN 3-527-30765-6
A.S. Bommarius, B.R. Riebel
Biocatalysis – Fundamentals and Applications
2004, ISBN 3-527-30344-8
T. Dingermann, D. Steinhilber, G. Folkers (eds.)
Molecular Biology in Medicinal Chemistry
2003, ISBN 3-527-30431-2
S. Brakmann, K. Johnsson (eds.)
Directed Molecular Evolution of Proteins
2002, ISBN 3-527-30423-1
V. Braun, F. Götz (eds.)
Microbial Fundamentals of Biotechnology
2001, ISBN 3-527-30615-3
Evolutionary
Methods in
Biotechnology
Clever Tricks for Directed Evolution
Edited by Susanne Brakmann
and Andreas Schwienhorst
Dr.SusanneBrakmann
InstitutfürZoologie
AngewandteMolekulareEvolution
UniversitätLeipzig
Liebigstr.18
04103Leipzig,Germany
[email protected]
Dr.AndreasSchwienhorst
InstitutfürMikrobiologieundGenetik
UniversitätGöttingen
Grisebachstr.8
37077Göttingen,Germany
[email protected]
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ISBN3-527-30799-0
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Contents
1 Introduction
SusanneBrakmannandAndreasSchwienhorst. . . . . . . . . . . . . . . . . 1
References. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3
2 GenerationofMutantLibrariesUsingRandomMutagenesis
SusanneBrakmannandBjörnF.Lindemann . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5
2.1 Introduction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5
2.2 Materials . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6
2.2.1 MaterialsforRandomPCRMutagenesis . . . . . . . . . . 6
2.2.2 MaterialsforMutatorStrainPassage . . . . . . . . . . . . 6
2.3 Protocols . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7
2.3.1 ProtocolforRandomPCRMutagenesisAccordingtoJoyce 7
2.3.2 ProtocolforMutatorStrainPassage . . . . . . . . . . . . 8
2.4 Troubleshooting . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10
References. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11
3 DNAShuffling
HikaruSuenaga,MasatoshiGoto,andKensukeFurukawa . . . . . . . . . . 13
3.1 Introduction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13
3.2 Materials . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15
3.2.1 ForPreparationofParentalGenes. . . . . . . . . . . . . . 15
3.2.2 ForRandomFragmentationbyDNaseI . . . . . . . . . . 15
3.2.3 ForCollectionofDNAFragments
inSpecificMolecularSizeRanges . . . . . . . . . . . . . 16
3.2.4 ForReassemblyofTheseFragmentsbyPrimerlessPCR . 16
3.2.5 ForAmplificationofReassembledProducts
byConventionalPCRwithPrimers . . . . . . . . . . . . . 16
3.3 Protocol . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17
3.3.1 PreparationofParentalGenes . . . . . . . . . . . . . . . . 17
3.3.2 RandomFragmentationbyDNaseI. . . . . . . . . . . . . 17
3.3.3 CollectionofDNAFragments
inSpecificMolecularSizeRanges . . . . . . . . . . . . . 18
3.3.4 ReassemblyofTheseFragmentsbyPrimerlessPCR . . . 19
3.3.5 AmplificationofReassembledProducts
byConventionalPCRwithPrimers . . . . . . . . . . . . . 20
VI Contents
3.4 Troubleshooting . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21
3.4.1 InsufficientDNaseIFragmentation . . . . . . . . . . . . . 21
3.4.2 LittleorNoProductofPrimerlessPCR . . . . . . . . . . 21
3.4.3 LittleorNoProductofPCRwithPrimers . . . . . . . . . 21
3.4.4 TheProductofPCRwithPrimersisMulti-banded . . . . 22
3.5 AmplificationExamples . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22
References. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23
4 DNARecombinationUsingStEP
MilenaNinkovic . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25
4.1 Introduction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25
4.2 Materials . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26
4.2.1 StEPPCR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26
4.2.2 PurificationofanAppropriateDNAFragment . . . . . . 27
4.2.3 Equipment . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27
4.3 Protocol . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27
4.4 TechnicalTips . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28
4.4.1 Problem:LittleorNoPCRProduct
(Full-lengthProduct)afterPCR . . . . . . . . . . . . . . . 28
4.4.2 Problem:HighBackgroundLevelsofDNAafterPCR . . 28
4.5 StEPinDirectedEvolution . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29
References. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30
5 FACSScreeningofCombinatorialPeptideandProteinLibraries
DisplayedontheSurfaceofEscherichiacoliCells
ThorstenM.Adams,Hans-UlrichSchmoldt,andHaraldKolmar . . . . . . . 31
5.1 Introduction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31
5.2 Materials . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35
5.2.1 EscherichiacoliStrainsandPlasmids . . . . . . . . . . . 35
5.2.2 LiquidMediaandAgarPlates . . . . . . . . . . . . . . . . 35
5.2.3 BiologicalandChemicalMaterials . . . . . . . . . . . . . 36
5.2.4 Equipment . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36
5.3 Protocols . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36
5.3.1 VerificationofCellSurfaceExposure
ofthePassengerProtein . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36
5.3.2 LabelingoftheTargetProtein . . . . . . . . . . . . . . . . 37
5.3.3 LibraryConstruction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37
5.3.4 CombinatorialLibraryScreeningbyFACSandMACS. . 40
5.4 Troubleshooting . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42
5.5 MajorApplications . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44
References. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44
6 SelectionofPhage-displayedEnzymes
PatriceSoumillion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47
6.1 Introduction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47
6.2 Materials . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50
Contents VII
6.2.1 Buffers,ReagentsandConsumables . . . . . . . . . . . . 50
6.2.2 StrainsandVectors . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50
6.3 Protocols . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51
6.3.1 ThePhage-enzyme . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51
6.3.2 LibraryConstruction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 55
6.3.3 Selection . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 59
6.4 Troubleshooting . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 62
6.4.1 PhageTitersAreNotReproducible . . . . . . . . . . . . . 62
6.4.2 Phage-enzymesDegradewithTime. . . . . . . . . . . . . 63
6.4.3 PhagesAreNotGeneticallyStable . . . . . . . . . . . . . 63
6.4.4 The‘out/in’RatioDoesNotIncreasewithSelectionRounds 63
6.5 MajorApplications . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 63
References. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 64
7 SelectionofAptamers
HeikoFickert,HeikeBetat,andUlrichHahn. . . . . . . . . . . . . . . . . . 65
7.1 Introduction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 65
7.2 Materials . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 66
7.2.1 ImmobilizationofTargetMolecules . . . . . . . . . . . . 66
7.2.2 PCR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 67
7.2.3 InvitroTranscription . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 67
7.2.4 RNAPurification . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 67
7.2.5 SelectionofAptamers . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 67
7.2.6 ReverseTranscription . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 68
7.3 Protocols . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 68
7.3.1 SelectionofRNAAptamers . . . . . . . . . . . . . . . . . 68
7.3.2 Selectionof2(cid:2)-ModifiedRNAAptamers . . . . . . . . . . 75
7.3.3 SelectionofssDNAAptamers . . . . . . . . . . . . . . . . 76
7.3.4 CloningandSequencing . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 77
7.3.5 CharacterizationofAptamers . . . . . . . . . . . . . . . . 77
7.3.6 Example:IsolationofMoenomycinA-specificAptamers 79
7.4 Troubleshooting . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 82
7.5 MajorApplications . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 83
References. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 83
8 MethodsforSelectingCatalyticNucleicAcids
BenjaminL.Holley,andBruceE.Eaton . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 87
8.1 Introduction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 87
8.2 MaterialsandEquipment . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 88
8.3 Protocols . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 91
8.3.1 GeneratingtheStartingLibrary . . . . . . . . . . . . . . . 91
8.3.2 Transcription . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 97
8.3.3 Ligation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 99
8.3.4 NucleicAcid-catalyzedReactions. . . . . . . . . . . . . . 102
8.3.5 ReverseTranscription . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 104
VIII Contents
8.3.6 Partitioning . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 105
8.4 Troubleshooting . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 108
8.5 MajorApplications . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 109
References. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 109
9 High-throughputScreening
ofEnantioselectiveIndustrialBiocatalysts
ManfredT.Reetz . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 113
9.1 Introduction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 113
9.2 MaterialsandEquipment . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 115
9.2.1 AssaysBasedonMassSpectrometry . . . . . . . . . . . . 115
9.2.2 AssaysBasedonNMRSpectrometry. . . . . . . . . . . . 116
9.2.3 AssayBasedonFTIRSpectroscopy . . . . . . . . . . . . 116
9.2.4 AssaysBasedonUV/VisibleSpectroscopy . . . . . . . . 116
9.2.5 Enzyme-coupledUV/Visible-basedAssayforHydrolases 117
9.3 Protocols . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 117
9.3.1 AssaysBasedonMassSpectrometry . . . . . . . . . . . . 117
9.3.2 AssaysBasedonNMRSpectroscopy. . . . . . . . . . . . 121
9.3.3 AssayBasedonFTIRSpectroscopy . . . . . . . . . . . . 125
9.3.4 AssaysBasedonUV/VisibleSpectroscopy . . . . . . . . 129
9.3.5 Enzyme-coupledUV/Visible-basedAssayforHydrolases 132
9.3.6 FurtherAssays . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 133
9.4 Troubleshooting . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 138
9.4.1 CommentsontheKazlauskasTest . . . . . . . . . . . . . 138
9.4.2 PotentialProblemswhenPerformingKineticResolution. 138
9.5 Conclusions . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 139
References. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 139
10 Computer-assistedDesignofDopedLibraries
DirkTomandlandAndreasSchwienhorst . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 143
10.1 Introduction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 143
10.2 Materials . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 146
10.3 Protocol . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 147
10.4 Troubleshooting . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 150
10.5 MajorApplications . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 150
References. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 151
11 DirectedinsilicoMutagenesis
MarkusWiederstein,PeterLackner,FerryKienberger,ManfredJ.Sippl . . . 153
11.1 Introduction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 153
11.2 Materials . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 155
11.2.1 PDBFiles . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 155
11.2.2 Knowledge-basedPotentials . . . . . . . . . . . . . . . . . 156
11.2.3 Polyprotein,Z-scores . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 160
11.2.4 InsilicoMutagenesis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 162
11.2.5 Summary. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 163
Contents IX
11.3 Protocol . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 163
11.3.1 ProSaSetupandInteraction . . . . . . . . . . . . . . . . . 163
11.3.2 ProSaObjects . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 164
11.3.3 Session1(mut script1.cmd). . . . . . . . . . . . . . 164
11.3.4 Session2(mut script2.cmd). . . . . . . . . . . . . . 166
11.3.5 Session3(mut script3.cmd). . . . . . . . . . . . . . 168
11.3.6 Session4(mut script4.cmd). . . . . . . . . . . . . . 170
11.3.7 Tips&Tricks . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 171
11.4 Troubleshooting . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 173
11.5 MajorApplications . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 174
References. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 175
12 RNAFoldinginsilico
ChristophFlamm,IvoL.Hofacker,PeterF.Stadler . . . . . . . . . . . . . . 177
12.1 Introduction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 177
12.2 Materials . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 178
12.2.1 TypographicalConventions . . . . . . . . . . . . . . . . . 179
12.2.2 RNAWebServices . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 180
12.3 Protocols . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 181
12.3.1 SecondaryStructuresforIndividualSequences . . . . . . 181
12.3.2 ConsensusStructuresofaSampleofSequences. . . . . . 183
12.3.3 SequenceDesign . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 184
12.3.4 AnalysisofSELEXExperiments . . . . . . . . . . . . . . 186
12.3.5 ANotefortheExperts:WriteyourOwnRNAPrograms. 187
12.4 Troubleshooting . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 187
12.5 Caveats . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 188
References. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 189
13 PatentinginEvolutionaryBiotechnology
MartinaLeimkühlerandHans-WilhelmMeyers . . . . . . . . . . . . . . . . 191
13.1 Introduction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 191
13.2 TheNatureofPatents . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 191
13.3 WhatCanBePatented . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 192
13.4 TheRequirementofNovelty . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 193
13.5 TheRequirementofInventiveness. . . . . . . . . . . . . . . . . . 196
13.6 TheRequirementofUtility. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 197
13.7 TheRequirementsofEnablementandWrittenDescription . . . . 197
13.8 PatentProsecution. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 199
13.9 SearchTools . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 204
13.10TheFirst-to-inventPrincipleoftheUnitedStates
andItsConsequencesonLaboratoryNotebookKeeping . . . . . 206
13.11Summary . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 209
References. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 209
SubjectIndex . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 211
