EVALUACIÓN DEL DAÑO DE ADN DE LINFOCITOS HUMANOS EXPUESTOS A CIPERMETRINA Y EXTRACTO ETANÓLICO DE SEMILLAS DE VITIS VINIFERA L. (VITACEAE) “UVA”

2015·8.7 MB·

by  Allen Mendoza Ávalos

ADN
dano
Evaluacion de de
del linfocitos
humanos
expuestos a cipermetrina y extracto
de de
etanolico semillas L.
vinifera
Vitis
"uva"
(Vitaceae)
DNA
human
damage
Evaluation of
in
lymphocytes exposed cypermethrin and
to
of
ethanolic extract seeds vinifera L.
Vitis
"grape"
(Vitaceae)
&
Mendoza Leon Nomberto
Allen Avalos, Carlos Torres Carlos Rodriguez
Facultad de Ciencias Biologicas. Universidad Nacional de Trujillo-Peru.
[email protected]; [email protected]; [email protected];
Betzabet Bardales Vdsquez
Cecilia
Facultad de Ciencias. Universidad Privada Antenor Orrego. Trujillo-Peru
[email protected]
ARNALDOA
Enero-Junio 2014 241
21
(1):
I
Resumen
"uva" se utilizo la electroforesis alcalina de una sola celula (ensayo cometa). Los linfocitos fueron
aislados de muestras de sangre obtenidas de 6 donantes sanos, no fumadores con un rango de edad
GIBCO™ PB-MAX™
Medium
de 20 y 26 anos y se cultivaron en Karyotyping por 24 horas. Los
un
linfocitos fueron sometidos a pre-tratamiento con soluciones de extracto etanolico de semilla
ppm
de Vitis vinifera L. "uva" a concentraciones de 15 y 40 durante 1 hora y transcurrido este
tiempo fueron tratados con cipermetrina a una concentracion de 20 ppm. Para ensayo cometa
el
se uso el metodo establecido por Olive et al, 1992 modificado por Castillo, 2012. Los resultados
ADN
"uva" Cipermetrina muestran una disminucion dano en inducido por
(Vitaceae) frente
y al el
Cipermetrina.
Dano ADN.
Palabras clave: Cipermetrina, Ensayo Cometa, del
Vitis vinifera,
Abstract
DNA
human
The present study objective of evaluating the damage in lymphocytes induced by
cypermethrin and the protective effect of the ethanolic extract of Vitis vinifera L. (Vitaceae) "grape"
seeds. This study used the alkaline single-cell gel electrophoresis (comet assay). Lymphocytes were
isolated from blood samples obtained from 6 healthy, non-smokersdonors, within an age range of
™
PB-MAX™
GIBCO Medium
20-26 years, and afterwards cultured in Karyotyping which was
C
incubated at 37 ° for 24 hours. Lymphocytes were pre-treatedwith an ethanolic extract of Vitis
ppm
vinifera L. (Vitaceae) "grape" seed solution at concentrations of 15 and 40 for 1 hour and after
this time they were treated with Cypermethrin at a concentration of 20 ppm, hydrogen peroxide
mM
50 was considered as positive control and Phosphate Buffer (PBS) as a negative control. The
comet assay was done following the method established by Olive 1992. The results showed
et ah,
DNA
damage
cypermethrin presented a diminution induced by Cypermethrin; thus concluded
it's
that pretreatment of lymphocytes with ethanolic extract of V. vinifera L. (Vitaceae) seeds significantly
DNA
reduces damage caused by cypermethrin.
DNA
Key words: Cypermethrin, comet Damage.
assay,
Vitis vinifera,
Introduccion o rosado en bayas de "uva",
las estos
compuestos pertenecen a la familia de los
"uva",
Vitis vinifera L. (Vitaceae) es
flavonoides, son oligomeros polimeros de
y
una de economicamente mas
especies
las
unidades
las del polihidroxi flavanol-3, tales
importantes debido a sus diversos usos en
como
la (+)-catequina y la (-)-epicatequina
production de jugo de uva
vinos, industrial
&
(Bogdan Baumann, asimismo,
2009),
y otros productos alimenticios (Georgiev
poseen propiedades farmacologicas,
por
et al, 2014). Esta especie se caracteriza
quimiopreventivas, actividad antioxidativa
un
poseer contenido de compuestos
alto
de importancia en prevencion de
la
polifenolicos, los cuales se encuentran
enfermedades
cardiovasculares
y el
en
las cascaras y semillas. El extracto
tratamiento de trastornos de piel (Clifton,
que puede de
obtenerse sus semillas es
2004;Wetwitayaklung,
2008).
principalmente en proantocianidinas,
rico
numerosos que
Existen estudios
siendo los responsables del color rojo
ARNALDO
242 21 Enero - Junio, 2014
(1):
I
genotoxicidad sistemica en mamiferos,
la
ADN
y de reduction de radicales libres de las ya que causa danos en el en organos
proantocianidinas. Se ha demostrado que vitales mediados por radicales libres (Giri
&
mas Kocaman
de de "uva" son
los extractos semillas et al, 2003; Patel et al, 2006;
eficaces para eliminar radicales libres que Topaktas, 2009). Las rupturas en la cadena
Cy ADN
C
E mas
las vitaminas E, vitamina del a nivel de celulas individuals
y
P-caroteno contra la peroxidation lipidica mediadas por radicales libres pueden ser
ADN
&
y la frag tacion del en ratones medidas por el ensayo cometa (Arencibia
(Senthilmohana
et al, 2003; Attia et aZ.,2008; Rosario, 2009).
Zhou han
et al, 2012); estos efectos sido
de
actual,
muchos
tambien confirmados por estudios
cantidad de enfermedades cronicas-
la
con animales, en que proantocianidina
la
degenerativas que han asociado
se al
como
inhibe la tumorogenesis en los tejidos
excesivo uso de cipermetrina, surge
la la
la piel (Gali et al, 2008), colon (Dinicola et
necesidad de compuestos antioxidantes que
mama
de (Eng de
al, 2012), et al, 2003) y
sirvan para tratamientos preventivos de
los
la prostata (Raina et al, 2007). Por lo tanto,
de enfermedades, por
este tipo lo tanto, este
proantocianidinas han sido de gran
las
como
trabajo tuvo objetivo evaluar dano
el
interes en estudios para la dosificacion de
ADN
humanos
de de expuestos
linfocitos
como
personas expuestas a genotoxicos y
a cipermetrina y extracto etanolico de
un modulador muchas
potencial de dianas
de "uva"
semillas Vitis vinifera L. (Vitaceae)
moleculares en enfermedades cronicas
metodos
Material y
Actualmente, hay una presion cada
vez mayor en la industria agricola en todo Muestra: Los fueron obtenidos
linfocitos
mundo,
para producir mejores cosechas
el de muestras sanguineas de donantes
Como
de de una manera
calidad rentable. varones sanos (de edad comprendida entre
han
resultado, los pesticidas se convertido 20 y 26 afios) mediante centrifugacion (10
en componente mas en rpm
el utilizado el 000 por 10 min) e incubados a 37 °C
GIBCO™ PB-MAX™
programa integrado de control de plagas. durante 24 horas en
Una mas
de los compuestos usados para Karyotyping Medium. Para elaboration
la
control de plagas son los piretroides de
el del extracto se utilizo semillas V. vinifera
de origen sintetico; dentro los cuales la L. var. italiana obtenidas del Distrito de
uno mas
cipermetrina es de los utilizados La
Cascas, Libertad, Peru.
como
productos para cultivo de "vid"
el la
Metodos
como
producto domestico
(Kotonia,
y 2004).
Para preparation del extracto de
la
Algunos
estudios recientes, indicaron
semilla de semillas fueron
V. vinifera las
que uso de cipermetrina sobre cultivo
el el
secadas, molidas pesadas luego,
(100
y
g),
de "vid" en niveles de residuos de
la
se dejaron en reposo en etanol por 7 dias.
manera son
responsable, superiores a los
Transcurrido tiempo de maceration,
este se
maximos de (LMR)
residuos
limites
y,
separa disolucion etanolica del residuo
la
podria plantear problemas de salud debido
solido mediante filtration con papel El
filtro.
consumo
regular de esta fruta por parte
al
extracto etanolico asi obtenido, se concentra
de poblacion (Esmaeil, Se ha
la 2010).
por evaporation del disolvente hasta
demostrado, que Cipermetrina induce a
la
ARNALDOA
Enero-Junio 2014 243
21(1):
I
ADN
dano de d
1
reducir volun lido a mitad. se realizaron en oscuridad para prevenir
el la el
ADN
dano adicional que puede producir
al
Transcurrido 24 horas de incubacion
las
la luz. Se prosiguio a colocar los portaobjetos
de en
los linfocitos, se establecieron seis
un
en de
buffer electroforesis alcalino
grupos
experimentales, a los cuales se le
mM mM
NaOH pH
Na2EDTA;
(300 y 1
agrego de de "uva" con
extracto semilla
el
> durante 20 minutos, provocando
el
13),
ml
diferentes concentraciones 15, 40 \ig/ al
Luego
desenrrollamiento de doble hebra.
la
medio de cultivo y se dejo incubar a 37 °C
mA,
de la electroforesis (25 V, 300 20 min, 4
durante
1 hora.
suavemente
°C), los portaobjetos se lavaron
Despues con
del pretratamiento extracto uno
2 veces, a intervalos de 5 minutos cada
etanolico de la semilla de V. vinifera los con PBS 10 X. Para la visualizacion de los
incubaron durante hora
linfocitos se 1 linfocitos se tineron con 75 pi de Naranja de
con cipermetrina a una concentracion de un
acridina y revisados con microscopio de
ppm
20 y control positivo \iM de una
el (50 fluorescencia a amplificacion de 10X.
H
0
fue incubado durante 30 minutos
)
2 2 Toma
de datos procesamiento
y
y control negativo fue tratado con PBS.
el
En
cada muestra evaluaron
estadistico: se
Transcurrido tiempo,
este los linfocitos
100 linfocitos, para ello se realizaron la
fueron sometidos ensayo cometa
al
captura de imagenes de
los linfocitos
transcurrido 24 horas de aplicacion de
las la
DP2-BSW
mediante software
y se
el
ensayo cometa
la cipermetrina. El alcalino,
obtuvieron los parametros del test
de acuerdo con procedimiento
se realizo el
Moment,
del cometa: Olive Tail Tail
descrito Olive et al, 1992 modificado por
DNA
moment %
correspondientes
y Tail
Castillo para se realizaron
(2012), tal fin,
humanos
a los linfocitos expuestos a
preparaciones colocando 140 de agarosa
cipermetrina y extracto de semilla de Vitis
de punto de fusion normal (SIGMA) sobre
mediante software CometScore
vinifera, el
un
portaobjetos esmerilado y se dejo
(software
1.5 libre).
a temperatura ambiente; despues
solidificar
agrego una segunda capa de 210 Los datos obtenidos correspondientes a
se (140
|il
moment %
de agarosa de bajo punto de fusion [LMP, Olive Tail Moment, Tail y Tail
(xl
DNA
SIGMA] mas
70 de celulas sangumeas), fueron procesados estadisticamente
|xl
un
inmediatamente, mediante de
se coloco cubreobjetos el analisis varianza.
una
para obtener distribucion apropiada
Resultados
de celulas a lo largo de la primera capa
A
de entonces muestras colocaron En
gel, las se observo que
la Fig. 1. se las
min
a 4 °C por 10 para que solidificara. celulas expuestas Buffer fosfato (PBS) no
ADN,
Finalmente, se retiraron los cubreobjetos presentaron ninguna migracion del
sumergieron en una
y se los portaobjetos mantuvieron su forma mientras
esferica,
solucion de compuesta de detergentes que en B C mayor
lisis la Fig. y se evidencia
1.
M mM
ADN
concentradas NaCl, 100
y sales migracion cometa) en
(2,5 del (cola del las
mM
Na2EDTA, 1%
10 Triton
tris-HCl, celulas individuals expuestas a Peroxido
pH
X-100; 10) durante toda la noche a 4 °C. de Hidrogeno 50 |iM Cipermetrina 20
y
Con ppm
paredes
esta solucion, se lisaron las comparado con
las celulas tratadas
ADN
que
celulares y nucleares y el se con extracto de semilla de V. vinifera
D
dando
encontraba superenrrollado
se libero (ESU) (Fig.l. y E) en el cual las celulas
lugar a los nucleoides. Los siguientes pasos
ARNALl
244 21 Enero- Junio, 2014
(1):
I
DNA
%
manifestaron una pequena expansion que los valores de Tail fueron cercanos
ADN;
como
se traduce dano al mientras a los valores del control con Peroxido de
que las celulas expuestas a diferentes Hidrogeno 50 jxM y en los tratamientos
ppm
ESU mas ESU
concentraciones 15 y 40 del con cipermetrina se registra valores
y
cipermetrina manifestaron una disminucion promedios disminuidos signifativos con
ADN
del dano al (Fig.l. F G). respecto al control positivo y tratamiento
y
ppm
con cipermetrina 20 (Tabla
Fig.
1, 2).
ppm
El tratamiento con cipermetrina 20
Olive
Tail
Moment
Tratamientos
Tail
Moment
±0.33 +
0.87 0.742 0.45
Control positivo
nMH202)
(50
Cipermetrina 20
ppm
± ± ±
6.33 0.57 3.71 0.33 2.04 0.45
i
ppm
± ±0.33 ±0.45
6.25 0.57 3.45 1.65
)
ESU/
Cipermetri
ppm
15/20 8.83 ± 0.57 4.64 ± 0.33 2.46 ± 0.45
ppm
40/20 7.44 ± 0.57 4.18 ± 0.33 2.18 ± 0.45
evaluadas mediante ensayo cometa.
el
pueden
ensayo Estos danos, deberse a
iante la
el
pequeno tamano
naturaleza hidrofoba
y
cipermetrina induce roturas de hebras en molecular de la cipermetrina, lo cual le
ADN
membrana
de humanos; donde permite, pasar a traves de
el linfocitos los la
valores promedios para el % Tail DNA, Tail celular y llegar al nucleo. Se sugiere que
Moment Moment une
y Olive Tail en linfocitos dentro del nucleo la cipermetrina se
ADN
humanos expuestos a Cipermetrina a una al a traves de los grupos reactivos
concentracion de 20 ppm. Estos resultados de su resto acido, que conduce a la
como
concuerdan con los reportados por Patel desestabilizacion, asi el desenrollado
DNA,
donde cipermetrina a una del que podria ser un mecanismo
et (2006), la
al.
ppm
concentracion de 25 induce a roturas posible para su genotoxicidad. Se ha
ADN
de hebras en de de ratones demostrado en sistemas experimentales que
linfocitos
ARNALDOA
Enero-Junio 2014 245
21
(1):
I
T
A) Control negativo;
:
x
DE
T
H202);
B) Control positivo \iM
(50
:
2
T
C) Concentracion de cipermetrina 20 ml;
fig/
:
3
T
D) Concentracion de
e
4.
T
E) Concentracion de e to de semilla de V. vinifera 40 ng/ml;
:
5
T
F) Concentracion de e to de semilla de V. vinifera 15 ng/ml y
(
:
6
cipermetrina 20 ml;
fig/
T
G) Concentracion de de semilla de 40 ml
:to V. vinifera (ig/ ^
c
:
7
cipermetrina 20 ml.
fig/
Fig.l.Efecto protec
ARNALDO
246 21 Enero - Junio, 2014
(1):
I
T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7
Tratamientos
I 3
I
3
T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7
Tratamientos
I
I
T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7
Tratamientos
ARNALDOA
Enero-Junio 2014 247
21(1):
I
ADN
dano de d
1
de
actividad
la
i
y la generacion de especies reactivas de
oxigeno (ERO) cuales pueden causar
las
de que
evidencia,
i
ADN,
dano en que podria conducir
el lo
ADN
dano en observado despues de
el el la
a roturas de cadena simple y la mutacion
una
exposicion a la cipermetrina, podria ser
(Kale et al, 1999; Giray et al, 2001; Zegura et
consecuencia del ataque de los radicales
Saxena
al, 2004; etal, 2005).
ADN. De
sobre manera,
libres el esta la
ADN
Otro estudio, realizado por Attia et induccion a danos en el de linfocitos
humanos
2010 determino mediante ensayo expuestos a cipermetrina puede
al, el
cometa que pre-tratamiento con conducir a un aumento en susceptibilidad
el la
de de enfermedades en
proantocianidinas semilla V. hacia y trastornos los
ADN
disminuye dano en de humanos. Por importancia
vinifera el el seres lo tanto, la
medula osea de ratones ocasionado por de estudio radico en capacidad
este la
Doxorubicina a una concentracion de 12 de interceptacion de radicales libres y de
mg/kg, cuyos resultados mostraron una especies reactivas de oxigeno (ERO) del
reduccion altamente significativa en los extracto de semilla de "uva", que pueden
Moment, % DNA,
parametros Tail Tail ser ocasionados por la exposicion a
Moment
Tail Length y Olive del ensayo cipermetrina, obteniendose una reduccion
ADN
cometa. Demostrando de esta manera del dano al de linfocitos humanos
que proantocianidinas de semilla expuestos a cipermetrina.
las la
de "uva" interceptaron los radicales de
Conclusiones
superoxido, hidroxilo, radicales peroxilo,
quelaron metales redox-
peroxinitrito y los Los resultados obtenidos en este
activos, protegiendo de esta manera a estudio, indican que la exposicion de los
membranas
las celulares contra el ataque linfocitos humanos a la cipermetrina a 20
ADN
ppm
oxidativo generado por la Doxorubicina. ocasiona dano en de manera
el
significativa
A (p<0.05).
pesar de su para
eficacia la
de
interceptacion los radicales libres, El extracto etanolico de semilla de
Vitis
ppm
especies reactivas de oxigeno, el extracto de a concentraciones de 15
vinifera las
y
ppm
de muestra poco dano
semilla V. vinifera al 40 produce una reduccion del dano del
ADN
ADN
en comparacion dano ocasionado humanos
al de ocasionado por
linfocitos
por el Peroxido de Hidrogeno 50 |^M y Cipermetrina, demostrado a traves de los
ADN
%DNA
Cipermetrina 20 ppm. Este dano al parametros de Moment
in Tail, Tail
puede deber algunos de compuesto Moment
se a los Olive
y Tail.
citotoxicos del extracto de semilla de "uva".
Literatura citada
Xia 2010 reporto sobre toxicidad
et al, la
&
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se
la
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