Etude des fonctions mitotiques du domaine amino-terminal de CENP-A

128 Pages·2017·11.26 MB·French

Etude des fonctions mitotiques du domaine
amino-terminal de CENP-A
Damien Goutte-Gattat
To cite this version:
Damien Goutte-Gattat. Etude des fonctions mitotiques du domaine amino-terminal de CENP-A.
Autre [q-bio.OT]. Université de Grenoble, 2011. Français. ￿NNT: 2011GRENV079￿. ￿tel-00716378￿
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THÈSE
Pour obtenir le grade de
DOCTEUR DE L’UNIVERSITÉ DE GRENOBLE
Spécialité : Biologie cellulaire et moléculaire
Arrêtéministériel:7août2006
Présentéepar
Damien GOUTTE-GATTAT
Thèse dirigée par Stefan DIMITROV
préparée au sein du laboratoire INSERM U823
et de l’École Doctorale Chimie et Sciences du Vivant
Étude des fonctions mitotiques du
domaine amino-terminal de CENP-A
Thèse soutenue publiquement le 16 décembre 2011,
devant le jury composé de :
Dr. Stefan DIMITROV
InstitutAlbertBonniot,Grenoble,directeurdethèse
Pr. Hans GEISELMANN
InstitutJeanRoger,Grenoble,président
Dr. Marie-Josèphe GIRAUD PANIS
LaboratoiredeBiologieetPathologiedesGénomes,Nice,rapporteur
Dr. Pierre JALINOT
LaboratoiredeBiologieMoléculairedelaCellule,Lyon,rapporteur
Dr. Marie-Noëlle PRIOLEAU
InstitutJacquesMonod,Paris,examinateur
Dr. Dimitrios SKOUFIAS
InstitutdeBiologieStructurale,Grenoble,examinateur
ii
Résumé
Le variant d’histone CENP-A est le facteur responsable de la détermination épigéné-
tique du centromère. Il permet le recrutement de nombreuses protéines centromériques, et
constitue ainsi la brique fondatrice du kinétochore. Il possède un domaine amino-terminal
non structuré dont la fonction précise reste encore à élucider, bien qu’il soit déjà établi
chez certaines espèces que ce domaine est requis pour le bon fonctionnement du cen-
tromère et conséquemment le bon déroulement de la mitose. Nous avons construit des
lignées cellulaires humaines exprimant stablement diverses formes mutantes de CENP-A,
qui nous ont permis de réaliser des expériences de pseudogénétique en supprimant l’ex-
pression de la protéine CENP-A endogène. Nous observons une augmentation drastique
du taux de défauts de ségrégation des chromosomes et de cellules plurinucléées dans des
cellules exprimant uniquement le domaine globulaire de CENP-A, ce qui est en accord
aveclesdonnéesdelalittératureetconfirmel’importancedudomaineamino-terminal.Un
phénotype similaire est observé dans des cellules exprimant une protéine CENP-A entière
mais dont le domaine amino-terminal n’est pas phosphorylable. Nos résultats montrent
l’implication de la phosphorylation de la sérine de CENP-A dans le bon déroulement de
la mitose, et suggèrent que la fonction mitotique du domaine amino-terminal est centrée
sur cette seule phosphorylation.
Mots-clés
chromatine, variant d’histone, mitose, phosphorylation
iii
Signalement de la thèse en langue anglaise
Title
Investigating Functions of CENP-A N-tail in Mitosis
Abstract
The histone variant CENP-A is the epigenetic factor responsible for centromere deter-
mination. It allows the recruitment of a handful of centromeric proteins, and thus acts as
the primary foundation for the kinetochore. It comprises an unstructured amino-terminal
domain to which no precise function has yet been assigned, although it is established in
somespeciesthatthemerepresenceofthatdomainisrequiredforpropercentromerefunc-
tion and thus successful completion of mitosis. We have established several human cell
linesstablyexpressingGFP-taggedCENP-Aconstructs, allowingustoperformpseudoge-
netic experiments by siRNA-mediated silencing of the endogenous CENP-A. Our results
show a dramatic increase of mitotic defects and plurinuclear cells when cells express only
the globular domain of CENP-A; this is in accordance with the litterature and confirms
the importance of the amino-terminal tail. More importantly, a similar increase of mitotic
defects is observed when cells express a full-length, but non-phosphatable, CENP-A. Our
results show the involvement of the phosphatable serine 7 of CENP-A in the successful
completion of mitosis, and may suggest that the role of the whole amino-terminal tail of
CENP-A could be reduced to this single phosphorylation event.
Keywords
chromatin, histone variant, mitosis, phosphorylation
Remerciements
Je remercie en premier lieu Stefan Dimitrov de m’avoir accueilli toutes ces années
dans son équipe et d’avoir supervisé ce travail de thèse.
Je remercie chaleureusement tous les membres de l’équipe no4; particulièrement Fa-
bienne Hans, qui a guidé mes premiers pas dans cet univers. Les anciens membres de
l’équipe, que j’ai vu partir avec une pointe de regret, sont pleinement concernés.
Je remercie encore les enseignants des UE BIO110, BIO121, BIO361 et BIO421 avec
qui j’ai effectué mes services de moniteur et d’ATER au cours des quatre dernières années.
Merci à Axelle pour nos nombreuses discussions et le soutien mutuel que nous nous
sommes apportés.
Un remerciement tout particulier à Patrick; c’est gràce à vous que tout cela a été
possible en premier lieu, je ne l’ai pas oublié.
Une pensée pour vous, Djessy, Yan et Joey. Il a suffi que je m’absente le temps de faire
quelques études — à peine dix ans — pour que vous deveniez des grands derrière mon
dos. Aux yeux de votre oncle vous resterez probablement « ses petits » pour encore une
bonne dizaine d’années.
iv
Table des matières
Table des figures . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . vii
Liste des tableaux . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . viii
Liste des abbréviations . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ix
I Introduction 1
1 La chromatine 2
1.1 Le nucléosome . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2
1.1.1 Les histones . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3
1.1.2 La particule de cœur . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5
1.1.3 Le chromatosome . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6
1.2 Niveaux d’organisation supérieurs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6
1.2.1 Le nucléofilament . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7
1.2.2 La fibre de 30 nm . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8
1.2.3 Le chromosome mitotique . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10
1.3 Dynamique chromatinienne . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11
1.3.1 Facteurs de remodelage . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11
1.3.2 Modifications post-traductionnelles des histones . . . . . . . . . . . 12
1.3.3 Variants d’histones . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14
2 La mitose 18
2.1 Déroulement et régulation de la mitose . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18
2.1.1 Déroulement de la mitose . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18
2.1.2 Régulation de la mitose . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19
2.2 Le fuseau mitotique . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22
2.2.1 Les microtubules . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22
2.2.2 Les centrosomes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23
2.2.3 Le kinétochore . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24
2.3 Mouvements des chromosomes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25
2.3.1 Accrochage au fuseau mitotique . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25
2.3.2 Congression . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26
2.3.3 Ségrégation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27
2.3.4 Le point de contrôle du fuseau mitotique . . . . . . . . . . . . . . . 28
3 La chromatine centromérique 31
3.1 Détermination épigénétique du centromère . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31
3.2 Structure de la chromatine centromérique . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32
3.3 Chromatine centromérique et transcription . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35
3.4 Le variant d’histone centromérique CENP-A . . . . . . . . . . . . . . . . . 35
v
TABLE DES MATIÈRES vi
3.4.1 Structure et conservation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35
3.4.2 Maintenance de CENP-A aux centromères . . . . . . . . . . . . . . 36
3.4.3 CENP-A et l’assemblage du kinétochore . . . . . . . . . . . . . . . 39
3.4.4 Fonctions extra-mitotiques . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40
3.4.5 CENP-A et pathologie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40
3.4.6 Le domaine amino-terminal . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41
II Matériels et méthodes 44
4 Matériels et méthodes 45
4.1 Construction des plasmides . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45
4.1.1 PCR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45
4.1.2 Construction de GFP-CENP-A et dérivés . . . . . . . . . . . . . . . 46
4.1.3 Construction de GFP-H3-CENP-A et dérivés . . . . . . . . . . . . . 47
4.2 Construction des lignées cellulaires . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47
4.3 ARN interférence contre CENP-A . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 48
4.4 Immunofluorescence . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 48
4.5 Préparation d’extraits protéiques nucléaires . . . . . . . . . . . . . . . . . . 49
4.6 Immunoblots . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50
4.7 Préparation d’extraits d’ARN poly-adénylés . . . . . . . . . . . . . . . . . 51
4.8 RT-PCR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51
III Résultats et discussion 52
5 Résultats 53
5.1 Introduction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 55
5.2 Results . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 58
5.2.1 A CENP-A tail is required in mitosis . . . . . . . . . . . . . . . . . 60
5.2.2 CENP-A tail phosphorylation is required in mitosis . . . . . . . . . 61
5.2.3 Localization of mitotic checkpoint proteins . . . . . . . . . . . . . . 63
5.2.4 CENP-A tail phosphorylation is required for CENP-C localization . 65
5.3 Discussion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 67
5.4 Acknowledgements . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 70
5.5 Supplementary figures . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 70
6 Discussion 75
6.1 De la validité des résultats . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 75
6.2 De l’importance du domaine amino-terminal de CENP-A . . . . . . . . . . 76
6.3 Du rôle de la phosphorylation de CENP-A . . . . . . . . . . . . . . . . . . 78
6.4 Des perspectives . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 80
A Autres publications 81
B Bibliographie 100
Table des figures
1.1 Le nucléosome . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3
1.2 Les histones de cœur . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4
1.3 La particule de cœur du nucléosome . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5
1.4 Le nucléofilament et la fibre chromatinienne . . . . . . . . . . . . . . . . . 7
2.1 Déroulement de la mitose . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19
2.2 Structure du kinétochore . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24
2.3 Attachements des kinétochores au fuseau mitotique . . . . . . . . . . . . . 29
3.1 Organisation de l’ADN centromérique . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32
3.2 Organisation de la chromatine centromérique . . . . . . . . . . . . . . . . . 34
3.3 Conservation des protéines CenH3 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36
5.1 CENP-A NH2-tails are highly divergent . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 58
5.2 CENP-A NH2-tail is required in mitosis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 59
5.3 CENP-A phosphorylation is required in mitosis . . . . . . . . . . . . . . . 62
5.4 Localization and behavior of checkpoint proteins . . . . . . . . . . . . . . . 64
5.5 Localization of CCAN anchor proteins . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 66
5.6 Role of CENP-A phosphorylation in mitosis . . . . . . . . . . . . . . . . . 68
5.7 Localization of GFP-CENP-A fusions . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 70
5.8 Duration of mitosis in GFP-CENP-A cell lines . . . . . . . . . . . . . . . . 71
5.9 SAC function in GFP-CENP-A cell lines . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 71
5.10 Localization of CENP-B . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 72
5.11 Localization of ZWINT . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 72
5.12 Localization of Bub1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 73
5.13 Localization of INCENP . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 74
vii
Liste des tableaux
4.1 Amorces utilisées . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46
4.2 Anticorps primaires. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 49
4.3 Anticorps secondaires. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50
viii
Liste des abbréviations
ADN acide désoxyribonucléique
ADP adénosine diphosphate
APC/C anaphase-promoting complex/cyclosome
ARN acide ribonucléique
ATP adénosine triphosphate
BSA bovine serumalbumin
CAD CENP-A distal complex
CATD CENP-A targeting domain
CENP-ANAC CENP-A nucleosome associated complex
CCAN constitutive centromere-associated network
CPC chromosomal passengers complex
CREST calcinosis, Raynaud’s phenomenon, esophageal dysmotility, sclerodactyly,
telangiectasia
dNTP désoxynucléotide triphosphate
END essential N-terminal domain
GFP green fluorescent protein
γ-TURC γ-tubulin ring complex
HAT histone acétyl transférase
HDAC histone déacétylase
HFD histone fold domain
H(K)MT histone (lysine) méthyl transférase
KMN Knl1–Mis12–Ndc80
MCAK mitotic-centromere-associated kinesin
MCC mitotic checkpoint complex
MMLV Moloney murine leukemia virus
NCP nucleosome core particle
PARG poly(ADP-ribose) glycohydrolase
PARP poly(ADP-ribose) polymérase
PBS phosphate buffer saline
PCM pericentriolar material
PCR polymerase chain reaction
ix