Etude de la diversité génétique et fonctionnelle de champignons du sol présentant une activité ...

198 Pages·2008·31.07 MB·French

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U.F.R. Sciences et Techniques Biologiques
Ecole Doctorale Ressources Procédés Produits Environnement
Département de Formation Doctorale Biologie-Agronomie-Environnement
Secteur Biologie Végétale et Forestière
S.C.O. - U.H.P. NANCY 1
BIBLIOTHÈQUE DES SCIENCES
Rue duJardinBotanique
54600VILLEPS-LES- A CY
Thèse
présentée pour l' btention du titre de
0
Docteur de l'Université Henri Poincaré, Nancy-I
en Biologie Végétale et Forestière
par Patricia LUIS
Etude de la diversité génétique et fonctionnelle de champignons du sol
présentant une activité laccasique : mise au point d'outils moléculaires et
application à l'étude comparative de sols agricoles et forestiers
Soutenue publiquement le 25 juin 2004
Membres du Jury:
Président: M. Michel CHALOT Professeur, UniversitéHenri Poincaré, Nancy
Rapporteurs: M. Jean-Charles MUNCH Professeur, Université de Munich, Allemagne
Mme Gabrielle VOGT Professeur, Université Saint-Jérôme, Marseille
Examinateurs: M. François BUSCOT Professeur, Université de Leipzig, Allemagne (Directeur de thèse)
M. FrancisMARTIN Directeur de Recherche, INRA, Nancy (Directeur de thèse)
UMR INRAlUHP 1136 Interaction Arbres/Micro-organismes, Centre INRA de Nancy (France)
Département d'Ecologie Terrestre, Institut de Botanique, Université de Leipzig (Allemagne)
S.C.o. - U.H.P. NANCY 1
BIBLIOTHÈQUEDES SCIENCES
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Copyright 1962 : reprinted by permission ofUnited Feature Syndieate, Ine.
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Table des matières
06
REMERCIEMENTS
07
AVANT-PROPOS
INTRODUCTIONGENERALE 08
I. LE SOL 09
1.1. La fraction minérale 09
1.2. La matière organique 10
1.3. Les différentes formes de carbone organique dans les sols 12
lA. La fraction biotique, activités biologiques et fonctionnement des sols 15
1.4.1. Les racines et la rhizosphère 15
1.4.2. Faune, microflore etqualitédes sols 17
1.4.3. Les organismesfongiques, structure etfonction 18
II. LADEGRADATIONDELAMATIERE ORGANIQUEDANSLES SOLS 20
2.1. Décomposition des différentes formes de carbone organique dans les sols 20
2.1.1. Décomposition des composantsfacilement dégradables 21
2.1.2. Décomposition des composants difficilement dégradables 22
La cellulose et les hémicelluloses 22
La lignine et les autres composésphénoliques 23
2.2. Le rôle primordial des champignons dans la décomposition 24
2.2.1 Forte capacité dégradatrice des débris insolubles 24
2.2.2 Lessuccessionsfongiques dans lesphénomènes de dégradation 26
III. ETUDE DE LA DIVERSITE GENETIQUE ET FONCTIONNELLE DES COMMUNAUTES 29
FONGIQUES
3.1. Outils permettant l'étude de la structuration génétique des communautés fongiques 29
3.1.1. Les carpophores donnent une image biaiséedes communautés 29
3.1.2. Le mycélium donne une imageplus exacte des communautés 30
3.1.3. Les approches moléculairespermettant la caractérisation de la diversité génétique au 33
sein des communautés àpartirde l'ADNextraitdes sols
3
3.2. Structuration génétique des communautés fongiques 34
3.2.1. Diversité etdistribution des espèces 34
3.2.2. Dynamique temporelle des espèces 36
3.3. Etablirles liens entre diversité d'espèces, physiologie et fonctionnement des écosystèmes 38
3.3.1. Analysede la diversité des gènesfonctionnels 39
3.3.2. Analyse de l'expression des gènesfonctionnels 40
3.3.3. Analysed'acides nucléiques marqués (Stable IsotopeProbing ouSIP) etmicroarrays 40
IV. LES LACCASESFONGIQUES 42
4.1. Les laccases, une famille d'enzymes largementdistribuée 42
4.2. Structure et fonction des laccases fongiques 43
4.2.1. Structure 43
4.2.2. Fonction 44
Enzyme impliquéedans desphénomènes de dégradation 44
Enzyme impliquéedans desphénomènes de biosynthèse 45
VI. OBJECTIFS 46
CHAPITRE1 48
Développement et évaluation d'une méthodemoléculairepermettant d'analyserspécifiquementparPCR
la diversité des gènes laccasiques de Basidiomycètes dans les sols
CHAPITREII 70
Caractérisation de la diversité etde la distribution des gènes laccasiques de Basidiomycètes au sein de
différents types de sols
CHAPITREIII 96
Optimisation d'une méthodemoléculairepermettantd'analyserparRT-PCR etPCRsemi-quantitative
lesprofils d'expression desgènes laccasiquespréalablementdétectés au niveau ADN
DISCUSSION GENERALE 114
Comprendre le fonctionnement dela communautéfongique dans les sols: une tâche difficile 116
Approches développées afin d'étudier la diversité génétique et fonctionnelle des champignons 117
4
Il
Basidiomycètes présentant une activité laccasiques dans les sols, avantages et contraintes
Evaluation de la diversité génétique des gènes laccasiques dans différents types de sols 119
Etude approfondie de la diversité génétique des gènes laccasiques dans un sol brun forestier 121
(Steigerwald en Bavière)
Diversitéglobale en gènes laccasiques 121
Distribution verticaledes gènes laccasiques 121
Distribution spatialedes gènes laccasiques 122
Distribution spatialedes espècesdominantes 123
Etude de l'expression des gènes laccasiques dans le même sol brun forestier 125
CONCLUSIONETPERPECTIVES 127
BIBLIOGRAPHIE 130
5
Remerciements
Je tiens tout d'abord à remercier mes deux encadrants sans qui ce travail n'aurait pas été
ce qu'il est. Un très grand merci à François Buscot qui m'a permis de réaliser ma thèse
sur ce sujet complexe mais non moins passionnant, merci pour sa disponibilité et pour
son encadrement tout au long de ces années. Un immense merci à Francis Martin qui
me suit depuis mon DEA, merci pour ses critiques toujours très constructives et pour
son soutien.
Je remerCIe également les membres du jury, rapporteurs et examinateurs, d'avoir
accepté d'évaluer ce travail.
Je me dois de saluer les nombreuses personnes que j'ai eu la chance de rencontrer ces
dernières années et qui m'ont aidé d'une façon ou d'une autre. Je m'excuse d'avance
auprès des oubliés:
Virginie Acheré, Joanne Bertaux, Karen Bertaux, Staver Bezhani, Verena Blanke, Boris
Borstler, Daniel Bouchard, Marc Buée, Carmen Calambos, Christophe Calvaruso, Jean
Louis Churin, David Cohen, Claude Coppin, Pierre-Emmanuel Courty, Christine
Delaruelle, Aurélie Deveau, Jesus Diez, Franck Ditengou, Sébastien Duplessis, Claudia
Eggert, Klemens Ekschrnitt, Pascal Frey, Pascale Frey-Klett, Jean Garbaye, Ute Hamer,
Anton Hartmann, Uwe Hell, Stefan Hempel, Sylvie Herrrnann, Anne Jambois, Jean-Luc
Jany, Micheal Kaldorf, Ellen Kandeler, Harald Kellner, Ingrid Kogel-Knabner,
Annegret Kohler, Erika Kothe, Sofia Kotowski, Claudia Krüger, Uwe Langer, Frédéric
Lapeyrie, Valérie Legué, François Le Tacon, Ryta Lomberh, Claude Murat, Angela
Nüske, Béatrice Palin, Véronica Pedera, Christina Popescu, Anke Renker, Carsten
Renker, Drasenka Selesi, Bemd Marschner, Martina Peter, Cécile Rinaldi, Blandine
Rimbault, Christina Schindler, Sandra Schmidt, Irena Sherameti, Sonja Spindler, Denis
Tagu, Nicole Thirion, Dominique Vairelles, Patrice Vion, Grit Walther, Yongjin Wang,
Bettina Zimdars.
Je dédis cette thèse à mes tendres parents Firmino et Ausenda qui m'ont soutenu sans
douter, à ma sœur Sandra la complice de tous les instants, à mon adorable belle-maman
Annie et àPatrick l'amour de ma vie.
6
Avaut-propos
Le présent travail a été réalisé dans le cadre d'une coopération entre le
Département des Sciences de l'Environnement de l'université d'Iéna dirigé par M. le
professeur François Buscot, puis à la suite de sa mutation à l'université de Leipzig,
entre le laboratoire d'Ecologie Terrestre et l'UMR 1136 INRAIUHP «Interaction
Arbres/Micro-organismes », dirigée par M. Francis Martin (Directeur de Recherche),
grâce à un fmancement (Bu 94111-1 & 1-2) obtenu par M. François Buscot auprès de la
fondation de recherche allemande Deutsche Forschung Gemeinschaft (DFG). Le projet
s'inscrit dans le cadre d'un programme concerté de la DFG (SPP 1090) intitulé « Les
sols comme sources et puits de CÛ2, mécanismes et régulation de la stabilisation de la
matière organique dans les sols» et impliquant une vingtaine d'équipes de recherche
allemandes. Les domaines d'investigation touchent toutes les fractions du sol pouvant
jouer un rôle dans la minéralisation et la stabilisation de la matière organique. Certains
laboratoires se focalisent sur l'étude des propriétés physico-chimiques des fractions
minérales et organiques, d'autres s'intéressent à l'édaphon (faune ou microflore) et aux
activités biologiques des sols. Les sols agricoles et forestiers analysés font partie de
placettes faisant l'objet d'essais permanents depuis plusieurs décennies.
Le travail de ce mémoire porte sur l'étude de la diversité génétique et
fonctionnelle des gènes laccasiques fongiques, et plus spécifiquement ceux des
Basidiomycètes, dans des sols forestiers et agricoles choisis. Par le biais de l'étude de
ces exo-enzymes impliquées dans les processus de dégradation (de la lignine et autres
polyphénols) et d'humification de la matière organique, il contribue à élucider une
partie du cycle du carbone dans les sols.
7
INTRODUCTION GENERALE
8
·N 1
BIBLIOTHÈQUE DES SCIENCES
RueduJardinBotanique
I. Le sol
64600VILLERS-LES-NANCY
Le sol est un substrat complexe composé de minéraux, de racines, de biomasse
végétale, animale et microbienne, de matière organique (MO) à différents stades de
décomposition, d'eau et d'atmosphère gazeuse (Killham, 1994). Le sol n'est pas un
milieu inerte et stable, il se forme, se développe et évolue sous l'influence du climat et
de la végétation à partir du matériau minéral initial (substratum géologique). A mesure
que l'évolution d'un sol se poursuit, celui-ci s'approfondit et se différencie en couches
successives (horizons) de plus en plus nombreuses, épaisses et distinctes, dont
l'ensemble constitue le profil (Duchaufour, 2001).
1.1. La fraction minérale
Si tout sol contient une certaine quantité de minéraux primaires «hérités» de la
roche mère (quartz, feldspath...), il est surtout caractérisé par la présence de nouveaux
minéraux, dits secondaires (argiles, oxydes libres...), résultant de l'altération
(transformation biochimique et géochimique) de certains minéraux primaires
(Duchaufour, 2001).
Les particules minérales, principales composantes formant la phase solide ou
matrice du sol, sont différentiables par leur taille. Ceci donne lieu à la distinction de
quatre classes, (1) les cailloux et graviers d'un diamètre supérieur à 2 mm qui sont
souvent des débris de la roche mère, (2) les sables de 2mm à 50 /lm (sables grossiers:
2 mm à 0.2 mm; sables fins: 0.2 mm à 50 /lm), (3) les limons (ou silts) de 50 /lm à
2 /lm (limons grossiers: 50 /lm à 20 /lm; limons fins: 20 /lm à 2 /lm) et (4) une
fraction fine inférieure à 2 /lm, communément appelée «argiles », formulation
cependant impropre car elle ne contient pas uniquement des argiles au sens
minéralogique mais aussi d'autres minéraux (Duchaufour, 2001).
Les dimensions de certaines particules du sol (pierres, sables, argiles...)
pourraient suggérer l'exclusion par la taille de certains organismes. Cependant, il
n'existe pas de corrélation simple entre la distribution des particules et celle des
organismes (Killham, 1994). En effet, la quantité et la nature des pores du sol sont non
9