Estudios Estructurales de Lectinas de Algas Marinas y de Vegetales Superiores

171 Pages·2007·4.05 MB·Spanish

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Instituto de
Biomedicina
de Valencia

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Estudios Estructurales de Lectinas de
D
Algas Marinas y de Vegetales Superiores
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T

Tesis Doctoral

O
N Celso Shiniti Nagano
A
Valencia, 2007
G
A
N

INSTITUTO DE

BIOMEDICINA

DE VALENCIA

Estudios Estructurales de Lectinas de Algas Marinas y de
Vegetales Superiores

TESIS DOCTORAL PRESENTADA POR CELSO SHINITI NAGANO PARA
OPTAR EL TÍTULO DE DOCTOR EN BIOQUÍMICA Y BIOLOGÍA MOLECULAR
DIRIGIDA POR LOS DOCTORES JUAN JOSÉ CALVETE Y LIBIA SANZ

Los Directores,

________________ ________________
Juan José Calvete Libia Sanz

El Doctorando,

_____________________
Celso Shiniti Nagano
Valencia, febrero de 2007
iii
A mi familia, a mis amigos
v

Índice

Página
Abreviaturas 03
1. INTRODUCCIÓN 05
1.1- Distribución de las lectinas 10
1.2- Aspectos generales del reconocimiento proteína-carbohidrato 10
1.3- Algunas aplicaciones biotecnológicas de las lectinas 12
OBJETIVOS 15
CAPÍTULO I
19
1.-Lectinas de Algas Marinas
1.1- Detección de lectinas de algas marinas 21
1.2- Purificación de lectinas de algas marinas 21
1.3- Propiedades biológicas de lectinas de algas marinas 26
1.4- Estructuras primarias de lectinas de algas marinas 26
2. MATERIALES Y MÉTODOS 29
2.1- Algas marinas 31
2.2- Extracción y purificación de la lectinas de Hypnea cervicornis e 31
Hypnea musciformis
2.3- Determinación de la masa molecular y cuantificación de cisteínas 33
libres y enlaces disulfuro
2.4- Digestiones proteolíticas y determinación de la secuencia de 34
aminoácidos
2.5- Búsqueda de similitud en secuencia de aminoácidos y patrón de 35
enlaces disulfuro
2.6- Ensayos de aglutinación de eritrocitos y de inhibición de la 35
hemoaglutinación
2.7- Ultracentrifugación analítica 36
2.8- Cristalización, recogida y procesamiento de datos 36
3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 39
3.1- Purificación y caracterización inicial de las lectinas de Hypnea 41
cervicornis e Hypnea musciformis
3.2- Caracterización de HCA y HML por espectrometría de masas 45
MALDI-TOF
3.3- Determinación de las estructuras primarias de HCA y HML 46
3.4- Características estructurales de HCA y HML 51
3.5- Determinantes de la inhibición de la actividad hemoaglutinante de 52
HCA y HML
3.6.-Cristalización de la Lectina de Hypnea musciformis 58
CAPITULO II 61
1.-LECTINAS VEGETALES
1.1-Consideraciones iniciales 63

1
Índice

Página
1.2.-Lectinas de leguminosas 64
1.2.1.-El sitio de unión a carbohidratos de las lectinas de leguminosas 66
1.3-Diversidad de estructuras cuaternarias entre las lectinas de leguminosas 68
1.4-Equilibrio dímero-tetrámero dependiente del pH 71
1.5-Biosíntesis y modificaciones post-traduccionales 73
2.MATERIALES Y MÉTODOS 75
2.1-Material Biológico 77
2.2-Extracción de ADN y ARN 77
2.3-Síntesis del ADNc 78
2.4-Clonaje del precursor de las lectinas de Dioclea guianensis (Dguia) y 78
de Dioclea grandiflora (DGL)
2.5-Construcción de las cadenas alfa de las lectina de Dioclea guianensis y 80
de Dioclea gradiflora.
2.6-Mutaciones puntuales. 81
2.7-Expresión recombinante de las proteínas de fusión r-α-tiorredoxina- 83
His
6
2.8-Purificación de la cadena alfa recombinante 83
2.9-Ultracentrifugación analítica 84
2.10-Cristalización, recogida, procesamiento de datos y construcción de 85
modelos
3 RESULTADOS Y DISCUSIÓN 87
3.1-Clonaje y amplificación de genes sintéticos de las lectinas de semillas 89
de Dioclea guianensis y de Dioclea grandiflora. (Dguia y DGL)
3.2-Construcción de la cadena madura (cadena alfa sintética) 93
3.3- Expresión recombinante de la cadena alfa sintética en E.coli 96
3.4-Cristalización de las lectinas r-αDguia y r-αDGL 98
3.5-Estructura cuaternaria dependiente del pH 106
CONCLUSIONES 115
BIBLIOGRAFIA 119
ANEXOS 141
Artículo 1-HCA and HML isolated from the red marine algae Hypnea
cervicornis and Hypnea musciformis define a novel lectin family. (2005). 143
Protein Science 14: 2167-76
Artículo 2-Crystallization and preliminary X-ray diffraction analysis of
HML, a lectin from the red marine alga Hypnea musciformis. (2005). Acta 151
Crystallographyca Section F 61: 997-999
Artículo 3-Lectinas. (2006). Investigación y Ciencia 361: 58-67 156

2
Abreviaturas

µg Microgramo
µl Microlitro
Å Angstrom (10-10m)
A Absorbancia
ADN Ácido desoxirribonucleico
ARN Ácido ribonucleico
CaCl Cloruro de calcio
2
CdCl Cloruro de cadmio
2
CID Disociación Inducida por Colisión (Collision-Induced
Dissociation)
cm Centímetro
CTAB Bromuro de cetil-trimetil amonio
DEAE Dietilaminoetil
DEPC Dietilpirocarbonato
DMSO Dimetilsulfóxido
dNTPs Desoxirribonucleótidos
DTT Ditiotreitol
EDTA: Ácido etilendiaminotetraacético
g Gramo
g constante gravitatoria 9,8 m/s
HCl Ácido clorhídrico
HEPES Ácido N-2-hidroxietilpiperazín-N’-2-etanosulfónico
IPTG Isopropil-β-D-tiogalactosidasa
K Grado Kelvin
Ka: Constante de afinidad
kDa Kilodalton
l Litro
LB Medio de cultivo Luria Bertani
M Molar
m/v Masa/volumen
m/z Masa/carga
MAD Dispersión anómala múltiple (Multiple Anomalous Dispersion)
MALDI-TOF-MS Espectrometría de masas de tiempo de vuelo con ionización por
ablación inducida por laser y asistida por matriz (Matrix Assisted
Laser Desorption Ionization-Time of Flight-Mass Spectrometry)
MES Ácido etanosulfónico
mg Miligramo
Reemplazo isomórfo múltiple (Multiple Isomorphous
MIR
Replacement)
ml Mililitro
mM Milimolar
MnCl Cloruro de manganeso
2
N Normalidad
NaCl Cloruro sódico
NaOH Hidróxido de sodio
nm Nanómetro
ºC Grado centígrado
OD: Densidad óptica (Optical Density)
pb Pares de base
PBS Tampón fosfato salino

3
Abreviaturas

PCR Reacción en cadena de la polimerasa (Polimerase Chain Reaction)
PEG Polietileno glicol
R Constante de los gases (8,314 mol-1K-1)
Amplificación rápida de extremos de ADNc (Rapid Amplification
RACE
of cDNA Ends)
RP-HPLC Cromatografía líquida de alta resolución en columna de fase
reversa (Reverse Phase-High Performance Liquid
Chromatography)
rpm Revoluciones por minuto
RT Transcripción reversa
SAD Dispersión anómala simple (Single Anomalous Dispersion)
SDS Dodecilsulfato de Sodio
SDS-PAGE Electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS (Polyacrilamide
Gel Electrophoresis)
TE Tampón tris-EDTA
TFA Ácido trifluoroacético
tris Tris (hidroximetil) amino-metano
U.H. Unidad de hemoaglutinación. Corresponde al inverso de la mayor
dilución de lectina capaz de producir aglutinación visible de una
disolución de eritrocitos al 2%).
UV-VIS Ultravioleta-visible
v/v volumen/volumen
X-Man 5-bromo-4-cloro-3-indolil-α-D-manosa

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INTRODUCCIÓN

5