erzurum bölgesinde 0-5 yaş arası gastroenteritli çocuklarda tespit edilen rotavirusların moleküler

78 Pages·2014·1.1 MB·Turkish

by  Dell Optiplex 990

ERZURUM BÖLGESİNDE 0-5 YAŞ ARASI
GASTROENTERİTLİ ÇOCUKLARDA TESPİT
EDİLEN ROTAVİRUSLARIN MOLEKÜLER
TİPLENDİRİLMESİ

Hakan AYDIN

Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı

Tez Danışmanı
Prof. Dr. Osman AKTAŞ

Doktora Tezi – 2014
T.C.
ATATÜRK ÜNİVERSİTESİ
SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ

ERZURUM BÖLGESİNDE 0-5 YAŞ ARASI
GASTROENTERİTLİ ÇOCUKLARDA TESPİT EDİLEN
ROTAVİRUSLARIN MOLEKÜLER TİPLENDİRİLMESİ

Hakan AYDIN

Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı
Doktora Tezi

Tez Danışmanı
Prof. Dr. Osman AKTAŞ

ERZURUM
2014
T.C.
ATATÜRK ÜNİVERSİTESİ
SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ
TIBBİ MİKROBİYOLOJİ ANABİLİM DALI

ERZURUM BÖLGESİNDE 0-5 YAŞ ARASI GASTROENTERİTLİ
ÇOCUKLARDA TESPİT EDİLEN ROTAVİRUSLARIN
MOLEKÜLER TİPLENDİRİLMESİ

Doktora Tezi
ERZURUM-2014
İÇİNDEKİLER
TEŞEKKÜR .................................................................................................................. III
ÖZET ............................................................................................................................. IV
ABSTRACT .................................................................................................................... V
SİMGELER VE KISALTMALAR DİZİNİ ............................................................... VI
ŞEKİLLER DİZİNİ ..................................................................................................... VII
TABLOLAR DİZİNİ ................................................................................................. VIII
1. GİRİŞ ........................................................................................................................... 1
2. GENEL BİLGİLER .................................................................................................... 4
2.1. Tarihçe ................................................................................................................... 5
2.2. Rotavirüslerin Sınıflandırılması ............................................................................. 6
2.3. Rotavirus Yapısı ve Antijenik Bileşenleri ............................................................. 8
2.4. Viral Replikasyon ................................................................................................ 11
2.5. RV Enfeksiyonlarının Patogenezi ve Önlenimi ................................................... 15
2.6. RV Enfeksiyonlarında Tanı ................................................................................. 19
2.7. RV Enfeksiyonlarının Tedavisi ve Aşılama ........................................................ 20
2.8. RV Enfeksiyonlarının Epidemiyolojisi ................................................................ 22
3. MATERYAL VE METOT ....................................................................................... 26
3.1. Örneklerin Toplanması ve Ön Hazırlık ............................................................... 26
3.2. Nükleik Asit İzolasyonu ...................................................................................... 26
3.3. Pozitif Kontrol ..................................................................................................... 26
3.4. RT-PCR (cDNA eldesi) ....................................................................................... 27
3.5. Multipleks-PCR ile G Genotiplerinin belirlenmesi ............................................. 28
3.6. Multipleks-PCR ile P Genotiplerinin belirlenmesi .............................................. 29
3.7. Jel Elektroforez ve Görüntüleme ......................................................................... 31
3.8. İstatistiksel Analizler ........................................................................................... 35
I
4. BULGULAR .............................................................................................................. 36
5. TARTIŞMA ............................................................................................................... 42
6. SONUÇ VE ÖNERİLER.......................................................................................... 49
KAYNAKLAR .............................................................................................................. 52
EKLER .......................................................................................................................... 66
EK-1. Özgeçmiş ............................................................................................................. 66
EK-2. Etik Kurul Onay Formu .................................................................................... 67

II
TEŞEKKÜR
Doktora eğitimim boyunca engin bilgi ve becerileri ile akademik hayatımın
sağlam temeller üzerine kurulmasında en büyük desteği olan danışmanım sayın Prof.
Dr. Osman AKTAŞ başta olmak üzere;

Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı Başkanı Sayın Prof. Dr. Ahmet
AYYILDIZ’a ve Anabilim dalının öğretim üyeleri Prof. Dr. Selahattin ÇELEBİ, Prof.
Dr. Ülkü ALTOPARLAK, Prof. Dr. Halil YAZGI, Prof. Dr. Ayşe Esin AKTAŞ, sayın
Doç. Dr. Hakan USLU ve Doç. Dr. Hamidullah UYANIK’a; çalışmalarımda büyük
desteğini gördüğüm Veteriner Fakültesi Viroloji Anabilim Dalı Başkanı Yrd. Doç. Dr.
Mehmet Özkan TİMURKAN'a; birlikte çalışmaktan mutluluk duyduğum Tıp Fakültesi
Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı asistan arkadaşlarıma ve tüm anabilim dalı
çalışanlarına; bu güne kadarki başarılarımı borçlu olduğum, şefkat ve sevgi pınarlarım
babam Osman AYDIN, annem Semra AYDIN, kardeşlerim Seval, Sinem ve İbrahim’e;
Fedakârlığı, iyi niyeti ve desteği ile her şartta yanımda olan yaşama sebebim eşim Ayşe
AYDIN’a; Lisans eğitimim boyunca emeklerini esirgemeyen başta Dekanımız Sayın
Prof. Dr. Derviş ÖZDEMİR ve tüm Veteriner Fakültesi hocalarıma ve bu çalışmayı
2013/013 BAP proje numarası ile destekleyen Atatürk Üniversitesi Bilimsel Araştırma
Projeleri Koordinatörlüğüne teşekkürü bir borç bilirim.
Hakan AYDIN

III
ÖZET
Erzurum Bölgesinde 0-5 Yaş Arası Gastroenteritli Çocuklarda Tespit
Edilen Rotavirusların Moleküler Tiplendirilmesi

Amaç: Bu çalışmanın amacı, yöremizdeki gastroenteritli çocuklarda ilk kez
rotavirüs genetik çeşitliliğini belirlemek ve yeni aşı çalışmalarına ışık tutacak
epidemiyolojik bir veri sağlamaktır.

Materyal ve Metot: Akut diyareli 0-5 yaş arası çocuklardan 329 gaita örneği
elde edilmiştir. Dışkıdan izole edilen rotaviral RNA örnekleri VP6, VP4 ve VP7 gen
bölgeleri yönünden reverz transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu ile araştırılmıştır.
Jel elektroforezi ile ayrıştırılan amplifikasyon ürünleri UV ışık altında görüntülenerek
genotipik veriler elde edilmiştir.

Bulgular: Gastroenteritli olguların 109 (% 33.1)'i rotavirus yönünden pozitif
bulunmuştur. Bölgesel olarak en dominant genotip kombinasyonu G1P[8] (42.2%) olup
bunu G9P[8] (21.1%), ve G12P[6] (% 11.0) izlemiştir. Rotavirus pozitif olgularda G
genotipleri içinde en yaygın olanı G1 (% 45.0) bulunmuş bunu sırasıyla G9 (% 32.1),
G12 (% 15.6), G2 (% 1.8), G4 (% 1.8) ve G3 (% 0.9) takip etmiştir. İki olguda G3+G9;
bir olguda G1+G9 olmak üzere toplam 3 (% 2.7) olguda miks G genotipi tespit
edilmiştir. P genotipleri arasında ise en yaygın olanı P[8] (% 72.5) bulunmuş bunu P[6]
(% 16.5) ve P[4] (% 7.4) takip etmiştir. İki olguda (% 1.8) miks enfeksiyon (birinde
P[4]+P[8], diğerinde P[6]+P[8]) tespit edilmiş 2 (% 1.8) olguda da P genotipi
tiplendirilememiştir.

Sonuç: Tüm dünyada olduğu gibi yöremizdeki rotavirus enfeksiyonu olan
olgularda da G1 ve P[8]’in en baskın genotipler olduğu görülmüştür. Çalışmadan alınan
sonuçlara göre yöremize özgü bir aşının hazırlanması planlandığında bu aşının, G1, G9,
G12 ve P[8] genotiplerine sahip RV suşlarıyla hazırlanması uygun olacaktır.

Anahtar Kelimeler: Agaroz jel elektroforez, Gastroenterit, G genotip, P
genotip, Rotavirus, RT-PCR.

IV
ABSTRACT
Molecular Typing of Rotaviruses Detected in Children Aged 0-5 with
Gastroenteritis in Erzurum Region

Aim: The aim of this study is to determine firstly the genetic diversity of
rotaviruses in children with gastroenteritis in our region and to provide epidemiological
data that will guide for the new vaccine studies.

Material and Method: RNA samples isolated from stool specimens of 329
children aged 0-5 years with acute diarrhea were investigated by reverse transcription
polymerase chain reaction for gene the presence regions of rotaviral VP6, VP4 and
VP7. Genotypic data were obtained by visualizing under the UV light the amplification
products separated by gel electrophoresis.

Results: Rotavirus RNA positivity were found 109 (31.1%) in the patients.
G1P[8] was the dominant genotype combinations regionally (42.2%), followed by
G9P[8] (21.1%), and G12P[6] (11.0%). The most common G genotype was G1
(45.0%), followed by G9 (32.1%), G12 (15.6%), G2 (1.8 %), G4 (%1.8) and G3 (0.9%),
respectively. Mixed G genotypes have been identified in three cases (2.7%) (G3+G9 in
two cases and G1+G9 in one case). The most common P genotype was P[8] (72.5%),
followed by P[6] (16.5%) and P[4] (7.4%). Mixed infections were identified in two
cases (one P[4]+P[8] and the other P[6]+P[8]) and P genotype could not be typed in the
2 patients.

Conclusion: As around the world, G1 and P[8] were found as the most
predominant genotypes in also patients with rotavirus infection in our region. According
to results from our study, a vaccine may composed of G1, G9, G12 and P[8] genotypes
of RV strains when planned the preparation of the vaccine to be used in our region.

Key Words: Agarose gel electrophoresis, Gastroenteritis, G genotypes, P
genotypes, rotavirus; RT-PCR.

V
SİMGELER VE KISALTMALAR DİZİNİ

bp : Baz çifti
cDNA : Komplementer DNA
DNA : Deoksiribonükleik asit
DSÖ : Dünya Sağlık Örgütü
ELISA : Enzim bağlı immünosorbent deneyi
(Enzyme Linked İmmunosorbent Assay)
ER : Endoplazmik retikulum
μL : Mikrolitre
NSP : Yapısal olmayan protein
ORT Oral rehidratasyon tuzları
PAGE : Poliakrilamid jel elektroforezi
PCR : Polimeraz zincir reaksiyonu
(Polymerase chain reaction)
RNA Ribonükleik asit
RT-PCR : Reverz transkriptaz- Polimeraz zincir reaksiyonu
Reverse transcriptase-Polymerase chain reaction
RV : Rotavirus
TAE : Tris asetat etilen diamin tetra asetik asit
(Tris acetate ethylene diamine tetra acetic acid)

VI
ŞEKİLLER DİZİNİ

Şekil No Sayfa No
Şekil 2.1. RV yapısının şematik gösterimi ..................................................................... 11
Şekil 2.2. RV replikasyonu ............................................................................................. 14
Şekil 3.1. Çalışmada kullanılan jel elektroforez sistemi ................................................ 32
Şekil 3.2. Çalışmada kullanılan UV görüntüleme sistemi .............................................. 32
Şekil 3.3. Agaroz jel üzerinde VP6 pozitif sonuç görüntüsü .......................................... 33
Şekil 3.4. Agaroz jel üzerinde P genotipleri ................................................................... 33
Şekil 3.5. Agaroz jel üzerinde VP4 pozitif sonuç ........................................................... 34
Şekil 3.6. Agaroz jel üzerinde G genotipleri .................................................................. 34
Şekil 3.7. Agaroz jel üzerinde VP7 pozitif sonuç ........................................................... 35
Şekil 4.1. Erzurum'da RV enfeksiyonlarının moleküler prevalansı ............................... 36
Şekil 4.2. RV pozitif olguların yaş gruplarına göre dağılımı ......................................... 38

VII