Endolysins as antibacterial agents: from engineering approaches to the uncovering of holin as a ...

219 Pages·2016·3.82 MB·English

by  Sofia Fernandes

UNIVERSIDADE DE LISBOA
FACULDADE DE FARMÁCIA

Endolysins as Antibacterial Agents:
from Engineering Approaches to the
Uncovering of Holin as a Key Factor
Influencing Lytic Activity

Orientador: Prof. Doutor Carlos Jorge Sousa de São-José

Ana Sofia Conceição Fernandes

Tese especialmente elaborada para a obtenção do grau de doutor em Farmácia,
especialidade de Microbiologia.

2016

UNIVERSIDADE DE LISBOA
FACULDADE DE FARMÁCIA

Endolysins as Antibacterial Agents: from
Engineering Approaches to the Uncovering
of Holin as a Key Factor Influencing Lytic
Activity

Orientador: Prof. Doutor Carlos Jorge Sousa de São-José

Ana Sofia Conceição Fernandes

Tese especialmente elaborada para a obtenção do grau de doutor em Farmácia,
especialidade de Microbiologia.

Júri
Presidente: Doulora Matilde da Luz dos Santos Duque da Fonseca e Castro
Vogais:
- Doutor Adriano José Alves de Oliveira Henriques. Professor Associado
Instituto de Tecnologia Química e Biológica da Universidade Nova de Lisboa;
- Doutor Ricardo Manuel Soares Parreira, Professor Auxiliar
Instituto de Higiene e Medicina Tropical da Universidade Nova de Lisboa;
- Doutor Mario Nuno Ramos d´Almeida Ramirez. Professor Associado corn Agregação
Faculdade de Medicina da Universidade de Lisboa;
- Doutor José Antonio Frazão Moniz Pereira. Professor Catedrótico
Faculdade de Farmácia da Universidade de Lisboa;
- Doutora Madalena Maria Vilela Pirnentel, Professora Associada
Faculdade de Farmácia da Universidade de Lisboa;
- Doutor Carlos Jorge Sousa de São José. Professor Auxiliar
Faculdade de Farmácia da Universidade de Lisboa, Orientador.

2016

A autora da investigação descrita nesta dissertação, Ana Sofia Conceição Fernandes, teve
o apoio da Fundação para a Ciência e a Tecnologia através da concessão da bolsa de
doutoramento SFRH/BD/81802/2011, com financiamento comparticipado pelo Fundo
Social Europeu e por fundos nacionais do Ministério da Ciência, Tecnologia e Ensino
Superior (MCTES).

O trabalho apresentado nesta dissertação foi desenvolvido no Centro de Patogénese
Molecular – Unidade de Retrovírus e Infeções Associadas (CPM-URIA) e no Instituto de
Investigação do Medicamento (iMed.ULisboa) da Faculdade de Farmácia da
Universidade de Lisboa (FFUL), sob a orientação do Prof. Dr. Carlos São-José.

Os resultados descritos nesta dissertação estão incluídos nos manuscritos publicados ou
submetidos para publicação abaixo indicados:

 Fernandes, S. and São-José, C. (2016) Probing the function of the two holin-
like proteins of bacteriophage SPP1. Submitted to Virology.

 Fernandes, S. and São-José, C. (2016) More than a hole: The holin lethal
function may be required to fully sensitize bacteria to the lytic action of canonical
endolysins. Molecular Microbiology. Accepted for publication on June 21, 2016.
DOI: 10.1111/mmi.13448.

 Fernandes, S., Proença, D., Cantante, C., Silva, F.A., Leandro, C., Lourenço,
S., et al. (2012) Novel chimerical endolysins with broad antimicrobial activity against
methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Microbial Drug Resistance 18: 333-43.
DOI: 10.1089/mdr.

De acordo com o disposto no ponto 1 do artigo n° 45 do Regulamento de Estudos Pós-
Graduados da Universidade de Lisboa, deliberação n° 4624/2012, publicado em Diário
da República – II Série n° 65 – 30 de Março de 2012, a autora desta dissertação declara
que participou na conceção e execução do trabalho experimental, interpretação dos
resultados obtidos e redação dos manuscritos.

TABLE OF CONTENTS

AGRADECIMENTOS ................................................................................................................ v
RESUMO ................................................................................................................................... vii
ABSTRACT ................................................................................................................................. xi
ABBREVIATIONS ................................................................................................................... xv

CHAPTER 1.
GENERAL INTRODUCTION

1.1 Bacteriophages: general features and life cycle .................................................................... 3
1.2 Bacterial cell envelope: barrier to virus entry and release .................................................... 4
1.3 Phage release from infected cells .......................................................................................... 8
1.3.1 Lysis players: holin/endolysin molecular diversity ................................................... 8
1.3.2 Lysis mechanisms in tailed phages ......................................................................... 16
1.3.2.1 Holin-dependent export of endolysins ................................................................ 19
1.3.2.2 Holin-independent export of endolysins ............................................................. 19
1.4 Lysis regulation: insights from autolysis in Gram-positive bacteria ................................... 23
1.4.1 The phenomenon of bacterial autolysis: first dissipate pmf and then lyse .............. 24
1.4.2 Autolysis regulation ................................................................................................ 26
1.5 Exploration of endolysins as antibacterial agents ............................................................... 28
1.5.1 Engineering of endolysins ....................................................................................... 29
1.5.2 Enzibiotic therapy: aren’t we missing something? .................................................. 31
1.6 Thesis goals ......................................................................................................................... 33
1.7 References ........................................................................................................................... 33

CHAPTER 2.
NOVEL CHIMERICAL ENDOLYSINS WITH BROAD ANTIMICROBIAL ACTIVITY
AGAINST METHICILLIN-RESISTANT STAPHYLOCOCCUS AUREUS

Acknowledgments ....................................................................................................................... 55
Abstract ....................................................................................................................................... 57
2.1 Introduction ........................................................................................................................... 59
2.2 Results ............................................................................................................................... 60
2.2.1 Production of chimerical endolysins targeting S. aureus ............................................. 60
2.2.2 Lytic action of the chimerical endolysins against clinical S. aureus ............................ 63
2.2.3 Lys168-87 and Lys170-87 have a synergistic lytic effect in liquid media ................... 66
i
2.2.4 Activity of the chimerical endolysins against other Gram-positive pathogenic bacteria
........................................................................................................................................... …..67
2.3 Discussion ............................................................................................................................. 69
2.4 Materials and methods .......................................................................................................... 72
2.4.1 Bacteria, culture media and growth conditions ............................................................ 72
2.4.2 Identification and bioinformatics analysis of phage endolysins ................................... 73
2.4.3 Construction and cloning of lys168-87 and lys170-87 chimerical genes ..................... 73
2.4.4 Production and purification of the chimerical endolysins Lys168-87 and Lys170-87
............................................................................................................................................... ..74
2.4.5 Evaluation of the lytic action of chimerical endolysins against bacterial pathogens .... 75
2.5 References ............................................................................................................................. 76
2.6 Supplementary materials ....................................................................................................... 81
2.6.1 References of tables and supplementary materials ....................................................... 93

CHAPTER 3.
MORE THAN A HOLE: THE HOLIN LETHAL FUNCTION MAY BE REQUIRED
TO FULLY SENSITIZE BACTERIA TO THE LYTIC ACTION OF CANONICAL
ENDOLYSINS

Acknowledgments ..................................................................................................................... 101
Abstract ..................................................................................................................................... 103
3.1 Introduction ......................................................................................................................... 105
3.2 Results ................................................................................................................................. 107
3.2.1 Actively growing B. subtilis cells can resist to the lytic action of secreted SPP1
endolysin ............................................................................................................................... 107
3.2.2 LySPP1-mediated lysis from without is enhanced in conditions leading to CM
depolarization ........................................................................................................................ 110
3.2.3 LySPP1 concentration requirements in lysis from within and from without ............. 112
3.2.4 Expression of SPP1 holin-like genes in B. subtilis increases cell susceptibility to
LysSPP1 ................................................................................................................................ 115
3.2.5 Lytic action of the staphylococcal 11 endolysin is drastically incremented in
gramicidin-treated cells ......................................................................................................... 117
3.3 Discussion ........................................................................................................................... 119
3.4 Materials and methods ........................................................................................................ 122
3.4.1 Bacterial strains, phages and growth conditions ........................................................ 122
3.4.2 General DNA techniques ........................................................................................... 122
3.4.3 General protein techniques ......................................................................................... 123
3.4.4 Cloning and expression of endolysin genes in E. coli ................................................ 124
3.4.5 Production and purification of His -tagged endolysins .............................................. 124
6
3.4.6 Cloning and expression of SPP1 lysis genes in B. subtilis ......................................... 125
ii