Einfluss von Arsen auf die DNA-Doppelstrangbruchreparatur und damit assoziierte zelluläre ...

160 Pages·2017·4.27 MB·German

by  Niemand, Rebecca Katharina

Einfluss von Arsen auf die
DNA-Doppelstrangbruchreparatur und damit
assoziierte zelluläre Signalwege

Zur Erlangung des akademischen Grades einer
DOKTORIN DER NATURWISSENSCHAFTEN
(Dr. rer. nat.)
von der KIT-Fakultät für Chemie und Biowissenschaften
des Karlsruher Instituts für Technologie (KIT)
genehmigte

DISSERTATION
von
Rebecca Katharina Niemand
aus
Rheinstetten

KIT-Dekan: Prof. Dr. Reinhard Fischer
1. Referentin: Prof. Dr. Andrea Hartwig
2. Referent: Prof. Dr. Mikro Bunzel
Tag der mündlichen Prüfung: 05.02.2018

Eidesstattliche Versicherung

Ich erkläre hiermit, dass ich die vorliegende Arbeit selbstständig verfasst habe und keine
anderen als die angegebenen Hilfsmittel verwendet habe. Darüber hinaus erkläre ich, dass
die Arbeit nicht anderweitig als Prüfungsarbeit oder als Dissertation bei einer anderen
Fakultät verwendet wird oder wurde.

Karlsruhe, den 08.01.2017 Rebecca Katharina Niemand

Inhaltsverzeichnis
1 Zusammenfassung ............................................................................................................... 1
2 Einleitung .............................................................................................................................. 4
2.1 Arsen .................................................................................................................................. 4
2.1.1 Vorkommen und Verwendung von Arsen........................................................... 4
2.1.2 Arsenaufnahme und -metabolismus...................................................................... 5
2.1.3 Toxikologie von Arsen ............................................................................................ 6
2.2 DNA-Reparaturmechanismen ...................................................................................... 11
2.2.1 Bedeutung der DNA-Doppelstrangbruchreparatur ......................................... 12
2.2.2 Induktion, Erkennung und Detektion von DNA-Doppelstrangbrüchen ..... 13
2.2.3 Nicht-homologes end-joining .................................................................................. 16
2.2.4 Homologe Rekombination ................................................................................... 17
2.2.5 Einfluss von Arsen auf DNA-Reparaturmechanismen.................................... 19
2.2.5.1 Einfluss von Arsen auf die DNA-Einzelstrangbruchreparatur ...................... 19
2.2.5.2 Einfluss von Arsen auf die Basen-Exzisionsreparatur ..................................... 21
2.2.5.3 Einfluss von Arsen auf die Nukleotid-Exzisionsreparatur .............................. 22
2.2.5.4 Einfluss von Arsen auf die Mismatch-Reparatur .............................................. 24
2.2.5.5 Einfluss von Arsen auf die DNA-Doppelstrangbruchreparatur .................... 25
3 Fragestellung ...................................................................................................................... 27
4 Material und Methoden .................................................................................................... 29
4.1 Material ............................................................................................................................ 29
4.2 Methoden ........................................................................................................................ 29
4.2.1 Verwendete Zelllinien ........................................................................................... 29
4.2.2 Kultivierung der Zelllinien .................................................................................... 29
4.2.3 Kryokonservierung und Inkulturnahme der Zellen .......................................... 30
4.2.4 Inkubation der HeLa S3-Zellen ........................................................................... 30
4.2.5 Inkubation der TK6-Zellen .................................................................................. 31
4.2.6 Bestrahlung der Zellen .......................................................................................... 31
4.2.7 Bestimmung der zellulären Aufnahme................................................................ 31
4.2.7.1 Versuchsansatz ....................................................................................................... 31
4.2.7.2 Aufschluss der Zellen ............................................................................................ 32
4.2.7.3 Graphitrohr-Atomabsorptionsspektroskopie .................................................... 32
4.2.8 Zytotoxizitätsuntersuchungen in HeLa S3-Zellen ............................................ 33
4.2.9 Pulsfeld-Gelelektrophorese .................................................................................. 34
4.2.9.1 Versuchsansatz ....................................................................................................... 34
I
4.2.9.2 Probenaufarbeitung ............................................................................................... 34
4.2.9.3 Gellauf und Auswertung ....................................................................................... 34
4.2.10 Immunfluoreszenzfärbung ................................................................................... 35
4.2.10.1 Versuchsansatz ..................................................................................................... 35
4.2.10.2 Fixierung und Färbung ....................................................................................... 35
4.2.10.3 Datenanalyse ......................................................................................................... 36
4.2.11 Viabilitätsmessung und Zellzyklusphasenverteilung mittels Durchfluss-
zytometer ................................................................................................................. 37
4.2.11.1 Versuchsansatz ..................................................................................................... 38
4.2.11.2 Probenaufarbeitung ............................................................................................. 39
4.2.11.3 Analyse am Durchflusszytometer...................................................................... 39
4.2.12 Genexpressionsanalyse mittels High-Throughput RT-qPCR ............................... 39
4.2.12.1 Versuchsansatz ..................................................................................................... 40
4.2.12.2 RNA-Isolation ...................................................................................................... 40
4.2.12.3 Synthese der cDNA ............................................................................................. 41
4.2.12.4 Preamplifikation und Exonukleaseverdau ....................................................... 41
4.2.12.5 Primer- und Probenvorbereitung ...................................................................... 42
4.2.12.6 96x96 Dynamic Array IFC qPCR Analyse ....................................................... 42
4.2.12.7 Datenanalyse und Auswertung .......................................................................... 42
4.2.13 Mikrokerntest am Durchflusszytometer ............................................................. 43
4.2.13.1 Versuchsansatz ..................................................................................................... 43
4.2.13.2 Probenaufarbeitung ............................................................................................. 44
4.2.13.3 Analyse am Durchflusszytometer...................................................................... 45
4.2.14 PIG-A-Genmutationstest ..................................................................................... 45
4.2.14.1 Relative increase in cell counts ................................................................................... 45
4.2.14.2 Abreicherung der TK6-Zellen ........................................................................... 46
4.2.14.3 Versuchsansatz ..................................................................................................... 46
4.2.14.4 Probenaufarbeitung ............................................................................................. 47
4.2.14.5 Analyse am Durchflusszytometer...................................................................... 47
4.2.15 Statistik .................................................................................................................... 48
5 Ergebnisse und Diskussion .............................................................................................. 49
5.1 Zelluläre Aufnahme von Arsenit in HeLa S3-Zellen ................................................ 49
5.2 Zytotoxizität von Arsenit in HeLa S3-Zellen............................................................. 49
5.3 Einfluss von Arsenit auf die DNA-Doppelstrangbruchreparatur .......................... 52
5.3.1 Einfluss von Arsenit auf die Schadenserkennung der DNA-Doppelstrang-
bruchreparatur ........................................................................................................ 55
II
5.3.2.1 Einfluss von Arsenit auf phospho-ATM ........................................................... 55
5.3.1.2 Einfluss von Arsenit auf γH2AX ........................................................................ 57
5.3.1.3 Einfluss von Arsenit auf 53BP1 .......................................................................... 58
5.6.2 Einfluss von Arsenit auf das nicht-homologe end-joining .................................. 60
5.6.3 Einfluss von Arsenit auf die homologe Rekombination .................................. 63
5.6.3.1 Einfluss von Arsenit auf Rad51 ........................................................................... 63
5.6.3.2 Einfluss von Arsenit auf BRCA1 ........................................................................ 67
5.6.3.3 Einfluss von Arsenit auf Rad54 ........................................................................... 70
5.4 Einfluss von Arsenit auf die Zellzyklusphasenverteilung......................................... 72
5.5 Einfluss von Arsenit auf die Viabilität ........................................................................ 76
5.6 Einfluss von Arsenit auf die Genexpression .............................................................. 77
5.6.1 Einfluss von Arsenit auf das Genexpressionsmuster der DNA-Schadens-
antwort und -Reparatur ......................................................................................... 80
5.6.2 Einfluss von Arsenit auf das Expressionsmuster Zellzyklus-zugehöriger Gene
.................................................................................................................................. 84
5.6.3 Einfluss von Arsenit auf das Expressionsmuster Apoptose-assoziierter Gene.
.................................................................................................................................. 86
5.6.4 Einfluss von Arsenit auf das Genexpressionsmuster der oxidativen Stress-
antwort ..................................................................................................................... 86
5.7 Einfluss von Arsenit auf die genomische Stabilität ................................................... 87
5.7.1 Einfluss von Arsenit auf die Induktion von Mikrokernen .............................. 88
5.7.2 Einfluss von Arsenit auf das Auftreten von Genmutationen ......................... 90
5.7.2.1 Einfluss von Arsenit auf den „Relative increase in cell counts” .............................. 91
5.7.2.2 Untersuchung des Einflusses von Arsenit auf das Auftreten von Genmutat-
jh ionen mittels PIG-A-Genmutationstest ............................................................ 92
6. Zusammenfassende Diskussion ...................................................................................... 94
7 Literaturverzeichnis ......................................................................................................... 103
8 Anhang .............................................................................................................................. 115
8.1 Abkürzungsverzeichnis................................................................................................ 115
8.2 Abbildungsverzeichnis ................................................................................................. 121
8.3 Tabellenverzeichnis ...................................................................................................... 124
8.4 Verwendete Chemikalien und Kits ............................................................................ 125
8.5 Antikörper, Puffer und Lösungen ............................................................................. 128
8.5.1 Antikörper ............................................................................................................. 128
8.5.2 Lösungen und Puffer ........................................................................................... 128
8.5.2.1 Zellkultur ............................................................................................................... 128
8.5.2.2 Aufnahmeuntersuchung...................................................................................... 129
III
8.5.2.3 Viabilitätsuntersuchung ....................................................................................... 129
8.5.2.4 Pulsfeldgelelektrophorese ................................................................................... 129
8.5.2.5 Mikrokerntest ....................................................................................................... 130
8.5.2.6 PIG-A-Genmutationstest ................................................................................... 130
8.6 Verbrauchsmaterialien ................................................................................................. 131
8.7 Verwendete Geräte ...................................................................................................... 133
8.8 Verwendete Software ................................................................................................... 134
8.9 Sequenzen der verwendeten Primer .......................................................................... 135
8.10 Ergänzende Daten ........................................................................................................ 141
8.10.1 Ergänzende Daten zur zellulären Aufnahme von Arsenit in
HeLa S3-Zellen .................................................................................................... 141
8.10.2 Ergänzende Daten der Pulsfeld-Gelelektrophorese ....................................... 142
8.10.3 Ergänzende Daten der Immunfluoreszenzfärbung ........................................ 142
8.10.4 Ergänzende Daten zum Einfluss von Arsenit auf die Viabilität von
HeLa S3-Zellen .................................................................................................... 143
8.10.5 Ergänzende Daten zum Einfluss von Arsenit auf das Genexpressionsmuster
von HeLa S3-Zellen ............................................................................................. 143
8.10.2 Ergänzende Daten zum Einfluss von Arsenit auf den „Relative increase in cell
counts“ ..................................................................................................................... 146
9 Publikationsliste ............................................................................................................... 147
10 Danksagung ...................................................................................................................... 150

IV