DYNAMIQUE INTRANUCLEAIRE ET BIOGENESE DES ARNs H/ACA

212 Pages·2008·4.25 MB·French

UNIVERSITE TOULOUSE III – PAUL SABATIER
UFR SVT

THESE
pour obtenir le grade de
DOCTEUR DE L’UNIVERSITE TOULOUSE III
Discipline : Biologie Moléculaire

Présentée et soutenue
Par

Patricia RICHARD

Le 16 juin 2006

DYNAMIQUE INTRANUCLEAIRE ET BIOGENESE
DES ARNs H/ACA

JURY

M. David CRIBBS Président du Jury
M. Bruno CHARPENTIER Rapporteur
M. Manuel ECHEVERRIA Rapporteur
M. Jérôme CAVAILLE Examinateur
M. Tamás KISS Directeur de thèse

LABORATOIRE de BIOLOGIE MOLECULAIRE DES EUCARYOTES
INSTITUT d’EXPLORATION FONCTIONNELLE des GENOMES
118, route de Narbonne, 31062 TOULOUSE, Cedex 09, FRANCE
Et voici venu le temps des remerciements…
Je remercie les rapporteurs de ce travail, Bruno Charpentier et Manuel Echeverria, qui
ont accepté de faire partie des membres du jury. Je remercie également David Cribbs
pour avoir accepté d’être président de ce jury, ainsi que Jérôme Cavaillé et Tamás Kiss,
également membre du jury.

Je tiens particulièrement à remercier ma famille qui m’a toujours soutenue, dans les
bons comme les mauvais moments.

Un grand merci à Tamás qui m’a accueilli dans son équipe en DEA et qui m’a permis de
poursuivre ma thèse à ses côtés. Je tiens à remercier le brillant scientifique mais
également l’homme humble, simple, respectueux et plein d’humour qu’est Tamás. J’ai
passé cinq années merveilleuses à travailler à ses côtés sans jamais perdre confiance en
mon travail. Travailler avec Tamás, a été pour moi, ma plus grande chance et mon plus
grand privilège.

Je remercie bien sûr tous les autres membres de l’équipe en commençant par Michel qui
me soutient depuis mon DEA et qui a généreusement corrigé mon manuscrit. Je
remercie évidemment l’ensemble des Tamas’ Angels, Beáta, Eléonore, Elodie et Isabelle.
Merci à toutes pour votre soutien de tous les jours. Un merci particulier à Beáta qui m’a
offert la possibilité de travailler avec elle sur ce sujet que j’aime tant qu’est la
télomérase. Merci pour ta disponibilité, ton aide et ta générosité, toutes ces qualités qui
ont permis de faire place à une belle amitié. Un sincère merci à Eléonore qui va
beaucoup me manquer et à qui je souhaite tout le meilleur dans cette équipe. J’ai
également une pensée pour les autres thésards de l’équipe qui ont quitté le labo avant
moi, en particulier Xavier avec qui j’ai commencé mon DEA, Vera et bien sûr Arnold
qui m’a fait l’honneur et le plaisir d’être parmi nous le jour de ma thèse (et ça c’est
vraiment un gros effort pour Arnold !).

Je dois également remercier nos collaborateurs de Montpellier, Edouard Bertrand et
Céline Verheggen qui ont participé à beaucoup de mes travaux.

Je remercie Marie-Hélène Rénalier pour avoir été une tutrice idéale qui m’a appris les
bases essentielles de l’enseignement pendant mes trois années de monitorat.

Un autre grand merci à tout le LBME ! Ces années ont été formidables grâce à
l’ensemble des membres de l’IBCG. Merci à tous ceux qui travaillent dans l’ombre, à
l’atelier (Yves, Vincent, Jean-Marc, François, Alain et Gérard), à la laverie (Fatima,
Nathalie et Adri), et les autres (Jocelyne et Laurent, nos informaticiens, Chantal et
Christine, David, notre photographe). Merci également à Yvette qui m’a permis de faire
de nombreuses PCR grâce à ses oligos. Et bien sûr, je remercie tendrement mes
secrétaires préférées qui ont toujours été là pour moi. C’est à chaque fois un réel
moment de détente et de bonne humeur d’aller voir Cathy et Safi. Un petit clin d’œil à
Elodie qui suit dignement les traces de sa maman, pour notre plus grand plaisir !

Je tiens également à remercier Arnaud Castillo, mon professeur de Biologie Moléculaire
à l’IUT de St-Brieuc, qui m’a fait partager sa passion et m’a donné la confiance dont
j’avais besoin pour continuer mes études et suivre ses traces.

Un énorme merci à mes amis qui m’ont accompagné jusqu’ici. Merci à Ceux avec qui
j’ai partagé la difficile mais inoubliable année de DEA : Brice, Yoyo, Guillaume et Nico.
Merci à Coco pour son soutien (et Seb biensûr !), à Isa, p’tit Sylvain, Roxane, Elène et
Damien, Patrice, Hervé, Olive et Julie, Clé, Simon et Elé, Toff et Rosy, Vincent, Laurent
et Emma, Béa et Jérome, Jue, Erwan et Sarah chez qui ont a fait trembler le parquet
plus d’une fois ! Et enfin, merci à ma p’tite Lolo et son p’tit mari Yann. Merci pour cette
amitié presque incroyable tellement elle est belle, simple et sincère. C’est sûr, tu vas me
manquer là-bas de l’autre côté de l’Atlantique !

Et enfin, merci à celui qui m’a « supporté » depuis mon arrivée à Toulouse jusqu’à
aujourd’hui. Un soutien inconditionnel qui m’a permis de me relever pendant les
moments difficiles et de toujours croire en ma « petite étoile ». Merci à toi, Nico, merci
de m’avoir remis les pieds sur terre quand c’était nécessaire, merci d’avoir cru en moi
sans relâche, merci pour ton amour !

Je dédie donc cette thèse à tous ceux que j’aime…
RESUME

Les ARNs H/ACA remplissent des fonctions variées dans la cellule. Ils servent d’ARNs
guides pour les conversions d’uridines en pseudouridines des ARNs ribosomiques mais
également des snARNs du spliceosome. Les ARNs H/ACA nucléolaires, les snoARNs,
guident les modifications des ARNr alors que ce sont des ARNs H/ACA qui s’accumulent
dans les Cajal bodies, les scaARNs, qui guident les modifications des snARNs du
spliceosome transcrits par l’ARN polymérase II. Nous avons montré par une large analyse
mutationnelle d’un ARN chimérique artificiel que la localisation des scaARNs dans les Cajal
bodies ne dépendait que d’un court motif de quatre nucléotides situé au niveau des boucles
terminales 5’ et 3’ du domaine H/ACA et appelé « boîte CAB ». La boîte CAB est conservée
chez de nombreux organismes et est nécessaire et suffisante à la localisation des scaARNs
dans les Cajal bodies. De façon plus inattendue, l’ARN de la télomérase, hTR, responsable de
l’élongation des télomères lorsqu’il est associé à la reverse transcriptase hTERT, comporte
également un domaine scaARN dans sa partie 3’. Ce domaine H/ACA possède en effet une
boîte CAB, située au niveau de la tige boucle 3’ du domaine H/ACA, qui est responsable de la
localisation de hTR dans les Cajal bodies. Nous avons voulu comprendre la signification
biologique de cette accumulation dans les Cajal bodies tout au long du cycle cellulaire par une
approche d’hybridation in situ et d’immunofluorescence. L’étude de la dynamique
intranucléaire de hTR par microscopie à fluorescence nous a permis de mettre en évidence un
rôle de hTR, associé aux Cajal bodies, dans la régulation de l’élongation des télomères. Les
Cajal bodies pourraient en effet délivrer hTR, potentiellement associé à hTERT, directement
au niveau des télomères.
Nous nous sommes intéressés dans un deuxième temps, à l’expression et à la maturation des
sno/scaARNs H/ACA introniques. Alors que plusieurs travaux mettent en évidence
l’existence d’une synergie entre la machinerie d’épissage et la machinerie d’assemblage des
snoRNPs C/D, nos résultats montrent qu’au contraire, l’épissage et l’assemblage de la
particule H/ACA chez l’homme sont deux évènements indépendants. Nous apportons
également l’évidence que l’expression correcte des ARNs H/ACA nécessite une transcription
par l’ARN polymérase II et que la particule H/ACA s’associe très précocement au niveau du
pré-ARNm.
LISTE DES ABREVIATIONS

ADN : Acide désoxyribonucléique
ADNc : ADN complémentaire
ADNr : ADN ribosomique
ARNm : ARN messager
ARN pol I, II, III : ARN polymerase I, II, III
ARNr : ARN ribosomique
ARNt : ARN de transfert
BLM : Bloom syndrome protein
BrdU : bromo-deoxyuridine
BrUTP : bromoUTP
CBs : Cajal Bodies
CBP : CREB-binding protein
ChIP : Chromatine Immuno-Précipitation
CPSF100 : Cleavage/Polyadenylation Specificity Factor 100
CR : conserved region
CRM1 : chromosomal-region-maintenance 1
CstF77 : Cleavage stimulation Factor 77
CTK1 : Carboxy-Terminal domain Kinase 1
DAPI : 4’, 6-Diamidino-2-phenylindole : blue
DC : dyskératose congénitale
2’-O-me : 2’-O-méthylation
DDX1 : DEAD (Asp-Glu-Ala-Asp) box polypeptide 1
D. melanogaster : Drosophila melanogaster
E. coli : Escherichia coli
FISH : fluorescent in situ hybridization
FLIP : fluorescence loss in photo bleaching
FRAP : fluorescence recovery after photo-bleaching
FRET : fluorescence resonance energy transfer
GFP : Green Fluorescent Protein
hnRNPI : heterogeneous nuclear RNPI
IGCs : interchromatin granule clusters
ITS : internal spacer region
MRP : Mitochondrial RNA Processing
nt(s) : nucléotide(s)
ORF : Open Reading Frame
Pb : Paire de bases
PHAX : phosphorylated adaptor for RNA export
PML bodies : Promyelocytic Leukaemia bodies
Poly(A) : Polyadénylée
protéines SR : protéines riches en serine/arginine
PTF : Proximal element sequence-binding Transcription Factor
Rb : Rétinoblastome
RG : Arginine- and Glycine-rich
RNP : RiboNucleoProtein
S : unité Sevdberg
SAM : S-adénosyl-L-méthionine
SART3 : Squamous cell carcinoma antigen recognized by T-cells 3
scaARN : small Cajal Bodies specific ARN
S. cerevisiae : Saccharomyces cerevisiae
Site A, P, E du ribosome : A : Aminoacyl-tRNA ; P : Peptidyl-tRNA ; E : Exit
SMN : Spinal Motor Neuron
snARN: small nuclear ARN
snoRNP : small nucleolar RiboNucleoProtein
snRNP : small nuclear RiboNucleoProtein
SR : splice regulatory
TBP : TATA-binding protein
TERT : telomerase reverse transcriptase
TFIIF/H : Transcription Factor II F/H
Tgs1 : Tri-méthylguanosine synthase 1
TMG : 5’-trimethylguanosine
TPP1 : tripeptidyl peptidase I
TR : telomerase RNA
UBF : upstream binding factor
U2AF : U2 auxiliary factor
UTR : Untranslated region
SOMMAIRE

AVANT PROPOS........................................................................................ 3
INTRODUCTION....................................................................................... 4
DYNAMIQUE DU NOYAU : UNE ARCHITECTURE COMPLEXE................................5
1. Le noyau.....................................................................................................................5
2. Le nucléole.................................................................................................................6
2.1. Son organisation.................................................................................................6
2.2. Ses implications biologiques..............................................................................7
3. Les Speckles ou IGCs (Interchromatin Granule Clusters) et Paraspeckles................8
4. Les Sites de transcription...........................................................................................9
5. Les Cajal bodies.......................................................................................................10
5.1. Leur découverte................................................................................................10
5.2. Leurs composants.............................................................................................10
5.3. Leur formation.................................................................................................13
6. Les Gems.................................................................................................................14
7. Les PML bodies.......................................................................................................14
8. Les Cleavage bodies.................................................................................................16
9. Les Structures périnucléolaires................................................................................17
9.1. Le compartiment périnucléolaire (PNC pour PeriNucleolar Compartment)....17
9.2. Le domaine SAM68.........................................................................................17
10. Conclusion...........................................................................................................18
NUCLEOLE ET snoARNs..................................................................................................19
11. Biogenèse des ribosomes.....................................................................................19
12. Biogenèse des snoARNs......................................................................................21
13. Les snoARNs à boîtes C/D..................................................................................23
13.1. Structure et fonction.....................................................................................23
13.2. Assemblage de la particule...........................................................................25
13.3. Biogenèse des snoRNPs C/D.......................................................................27
13.4. Trafic intracellulaire.....................................................................................28
14. Les snoARNs à boîtes H/ACA.............................................................................30
14.1. Structure et fonction.....................................................................................30
14.2. Assemblage de la particule...........................................................................32
14.3. Biogenèse des snoRNPs H/ACA..................................................................36
14.4. Trafic intracellulaire.....................................................................................37
15. SnoRNP C/D versus snoRNP H/ACA.................................................................38
15.1. Association avec Nopp140...........................................................................39
15.2. Association avec SMN.................................................................................40
15.3. Association avec p50-p55 (Tip48-Tip49)....................................................40
16. Biogenèse de U6 ..................................................................................................41
17. Evolution..............................................................................................................42
18. Bases de données des snoARNs...........................................................................44
19. Conclusion...........................................................................................................45
CAJAL BODIES ET scaARNs............................................................................................46
20. La machinerie d’épissage.....................................................................................46
21. Biogenèse des snARNs du spliceosome transcrits par l’ARN pol II....................47
21.1. SMN, facteur d’assemblage .........................................................................48
21.2. Assemblage des snARNs.............................................................................49
21.3. Importance des modifications des snARNs..................................................50
1
22. Les scaARNs........................................................................................................50
22.1. La découverte de U85..................................................................................51
22.2. Les scaARNs introniques : une famille grandissante...................................51
22.3. Leur biogenèse.............................................................................................52
22.4. Les scaARNs : une fonction conservée depuis la levure ?...........................53
22.5. Une nouvelle organisation des ARNs C/D...................................................53
22.6. Conclusion...................................................................................................54
23. La télomérase.......................................................................................................55
23.1. Les télomères...............................................................................................56
23.2. hTERT.........................................................................................................57
23.2.1. Sa découverte et son activité........................................................................57
23.2.2. Sa localisation nucléaire...............................................................................58
23.3. hTR..............................................................................................................60
23.3.1. Structure et fonction de hTR........................................................................60
23.3.2. Les protéines associées à hTR......................................................................62
23.3.3. Sa localisation nucléaire...............................................................................63
23.4. La dyskératose congénitale ..........................................................................65
23.4.1. La forme liée au chromosome X..................................................................65
23.4.2. Les formes autosomales de la maladie.........................................................66
24. Conclusion...........................................................................................................67
PRESENTATION DES RESULTATS .......................................................68
I. SIGNAL DE LOCALISATION DANS LES CAJAL BODIES DES scaARNS :
découverte de la boîte CAB.................................................................................................69
I. 1. Introduction..................................................................................................................69
I. 2. Résultats.......................................................................................................................69
I. 3. Résultats complémentaires...........................................................................................81
I. 3. a. Identification des boîtes CAB du scaARN C/D-H/ACA U87...................................81
I. 3. b. Identification des boîtes CAB du scaARN H/ACA U92..........................................81
I. 4. Conclusion/perspectives...............................................................................................82
II. DYNAMIQUE INTRANUCLEAIRE DE hTR..............................................................83
II. 1. Introduction.................................................................................................................83
II. 2. Résultats......................................................................................................................83
II. 3. Conclusion/perspectives..............................................................................................95
III. EXPRESSION DES ARNs H/ACA INTRONIQUES CHEZ L’HOMME....................96
III. 1. Introduction................................................................................................................96
III. 2. Résultats.....................................................................................................................96
III. 3. Conclusion/perspectives...........................................................................................107
IV. ASSEMBLAGE DES PARTICULES C/D versus H/ACA.........................................110
IV. 1. Introduction.............................................................................................................110
IV. 2. Résultats..................................................................................................................110
CONCLUSION.........................................................................................119
I. ARNs introniques C/D et H/ACA : des mécanismes de biogenèses différents..........120
II. La boîte CAB : un motif court mais nécessaire et suffisant à la localisation dans les
CBs des scaARNs H/ACA.................................................................................................121
III. L’ARN de la télomérase : une autre fonction d’un scaARN......................................122
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES..................................................123

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AVANT PROPOS

La cellule eucaryote renferme un nombre impressionnant de structures dont la liste ne cesse
de s’accroître. Le compartiment cytoplasmique a été le premier à délivrer une grande partie de
ses secrets. La découverte de la traduction dans le cytoplasme a sans doute suscité un
engouement important pour la dissection de ce compartiment et des organelles qui le
composent. Le noyau, qui contient notre patrimoine génétique, est également un haut lieu de
compartimentation. En effet, il contient de nombreux corps nucléaires, qui, contrairement aux
organelles cytoplasmiques, ne sont pas délimités par une membrane. Il apparaît d’autant plus
fascinant que ces corps qui ne semblent délimités par « rien » puissent exister et perdurer tout
au long de la vie de la cellule. Ils résultent d’une dynamique intranucléaire très intense régie
en grande partie par une diffusion passive des protéines et des ARNs au travers du noyau. Ces
corps nucléaires, parmi lesquels, le célèbre nucléole, disparaissent en effet très souvent en
mitose pour se reformer à chaque nouveau cycle cellulaire. Lorsque le professeur Camillo
Golgi découvre en 1898, l’appareil réticulaire qui porte maintenant son nom, le professeur
Ramon Y Cajal découvre à la même époque, une petite structure ronde à l’intérieur du noyau
d’un neurone de rat. Alors que la découverte de l’appareil de Golgi suscite l’enthousiasme
général des scientifiques, la « maigre » découverte de Cajal passe inaperçue. Même si les
deux professeurs ont finalement partagé le prix Nobel pour leurs travaux respectifs sur la
structure du système nerveux en 1906, c’est le corps nucléaire découvert par Cajal en 1903,
longtemps appelés coiled bodies et dernièrement rebaptisés Cajal bodies en l’honneur de celui
qui les a observé et décrit pour la première fois, qui suscite maintenant un grand intérêt. En
effet, ce corps nucléaire longtemps ignoré participe, tout comme le nucléole et bien d’autres
corps nucléaires, à la dynamique fonctionnelle du noyau et à la régulation de l’expression
génique. Les Cajal bodies témoignent d’une dynamique intranucléaire longtemps
insoupçonnée, qui comprend de nombreux autres acteurs et sur laquelle repose sûrement de
nombreuses fonctions essentielles à la vie cellulaire.

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