dosage par chromatographie en phase gazeuse des acides gras liberes dans 32 les fractions

262 Pages·2009·3.07 MB·French

Université Louis Pasteur

Strasbourg I

THÈSE

présentée à la

FACULTÉ DES SCIENCES DE LA VIE

pour obtenir le titre de

DOCTEUR DE L’UNIVERSITÉ LOUIS PASTEUR
Domaine : Biologie Moléculaire et Biochimie Végétale

par

Alexandre NOIRIEL

Étude d’une famille de gènes d’Arabidopsis thaliana homologues
de la lécithine cholestérol acyltransférase humaine.
Caractérisation d’une nouvelle phospholipase A1 et étude d’une
stérol acyltransferase

Soutenue le 2 juillet 2004 devant la Commission d’examen :

M Pierre BENVENISTE Directeur de thèse
M Francis KARST Rapporteur interne
M Alain PUGIN Rapporteur externe
M Sten STYMNE Examinateur
M Alain ZACHOWSKI Rapporteur externe
Je tiens à exprimer ma reconnaissance et mes remerciements à

Monsieur Pierre Benveniste pour m’avoir accueilli dans son laboratoire et qui m’a ainsi
permis de réaliser ce travail de thèse

Messieurs Karst, Pugin, Stymne et Zachowski pour avoir accepté de juger ce travail

Pierrette Bouvier-Navé et Hubert Schaller qui ont guidé mes recherches

Jean-Luc Souciet, Claudine Bleykasten-Grosshans et Joseph Schacherer pour leurs conseils
avisés concernant la levure

Annie Hoeft, Màrta Ramel et Monique Schmitz qui m’ont assisté

ainsi qu’à toute l’équipe du laboratoire.

Enfin, une pensée particulière à toutes celles et tout ceux qui m’ont supporté (dans les deux
sens du terme) durant ces années…
Sciences sans conscience n’est que ruine de l’âme.
François Rabelais

Celui qui ne connaît pas l'histoire est condamné à la revivre.
Karl Marx

La célébrité m'a apporté un gros avantage : les femmes qui me disent non sont plus belles qu'autrefois.
Woody Allen
Thématique de la thèse
La quantité de stérols libres est extrêmement régulée dans les membranes. Un moyen
utilisé par les plantes pour réguler la teneur en stérols libres est d’estérifier ces stérols
excédentaires et de les compartimenter dans des vésicules extramembranaires. L’enzyme qui
estérifie les stérols, la stérol acyltransférase, joue donc un rôle majeur dans cette régulation.
Si de nombreux travaux biochimiques ont été consacrés à cette enzyme, le gène (ou les
gènes) codant pour la SAT restaient inconnus. Par analogie avec des SAT préalablement
caractérisées chez d’autres organismes, Champignons et Mammifères notamment, la SAT
végétale pouvait appartenir à la famille des ACAT ou des LCAT. Le séquençage systématique
du génome d’A. thaliana a permis de mettre en évidence plusieurs gènes homologues aux
ACAT ou aux LCAT. Dans le génome d’A. thaliana, la seule protéine apparentée aux ACAT
n’estérifie pas les stérols mais le diacylglycérol pour former un triacyglycérol, cette protéine
n’était donc pas la SAT recherchée. Les 4 gènes d’A. thaliana homologues à la LCAT
humaine étaient donc des candidats privilégiés pour coder une SAT végétale. Ces 4 gènes
AtLCAT1, AtLCAT2, AtLCAT3 et AtLCAT4 ont donc été exprimés in levuro et/ou in planta
dans le but de caractériser une SAT végétale.
Un premier chapitre est consacré à l’étude de AtLCAT3 dont nous avons montré
qu’elle code une phospholipase A1, nous verrons la caractérisation biochimique de cette
enzyme à la fonction inattendue, par expression dans la levure. Nous étudierons également les
conséquences marquées de l’activité enzymatique sur le métabolisme lipidique de la levure.
Le second chapitre est consacré à l’étude de AtLCAT2 qui code une stérol
acyltransférase végétale. Nous présenterons les conséquences de la surexpression et de la
mutation de cette protéine sur la quantité d’esters de stérols in planta. Nous étudierons aussi
le comportement de ces plantes cultivées dans des conditions où le métabolisme des esters de
stérols est affecté.
Enfin le dernier chapitre regroupe les résultats obtenus lors de l’étude de AtLCAT1 et
AtLCAT4, ainsi que les tentatives de modification de la quantité d’esters de stérols par
surexpression d’une SAT fongique. Un essai de clonage de la SAT végétale par
complémentation d’un mutant de levure sera également présenté.
Liste des abréviations

ACAT : acylCoA cholestérol acyltransférase
ADN : acide désoxyribonucléique
ADNc : acide désoxyribonucléique complémentaire
AG : acide gras
AG : acide gras libre
ARN : acide ribonucléique
ARNm : acide ribonucléique messager
ATP : adénosine triphosphate
BET : bromure d’éthidium
BSA : sérum albumine bovine
Ct : cycle seuil
CoA : coenzyme A
DMSO : diméthylsulfoxyde
dNTP : désoxyribonucléotide triphosphate
D.O. : densité optique
DTE : dithioérythritol
EDTA : éthylène diamine tétraacétate
FPP : diphosphate de farnésyle
G3P : glycéraldéhyde 3-phosphate
GGPP : géranyle géranyle diphosphate
GM : milieu de germination
h : heure
HDL : lipoprotéine de forte densité
HMG CoA : 3-hydroxy-3-méthylglutaryl coenzyme A
HMGR : 3-hydroxy-3-méthylglutaryl coenzyme A réductase
IPP : diphosphate d’isopentényle
Kb : Kilo paire de bases
KD : Kilo Dalton
KO : Knock-out
L : litre
LB : milieu de Luria Bertani
LCAT : lécithine cholestérol acyltransférase
LDL : lipoprotéine de faible densité
LPC : lysophosphatidylcholine
ORF : phase ouverte de lecture
pb : paire de bases
PC : phosphatidylcholine
PCR : réaction de polymérisation en chaîne
RE : réticulum endoplasmique
RNAse : ribonucléase
rpm : rotation par minute
s : seconde
SAT : stérol acyltransférase
SDS : dodécyl sulfate de sodium
TAE : tampon tris acétate EDTA
TAG : triacylglycérol
TE : tampon tris EDTA
Tris : tris-hydroxyméthyl-aminométhane
UV : ultra-violet
wt : wild-type (« sauvage »)
X-Gal : 5-bromo-4-chloro-3-indoyl-β-D-galactopyranoside
Liste des figures et tableaux :

Page
Figure 1 : Numérotation du squelette carboné des stérols d’après la nomenclature 1
I.U.P.A.C.

Figure 2 : Structure du noyau hopane et exemple d’hopanoïde. 1

Figure 3 : Structure des principaux stérols des eucaryotes. 2

Figure 4 : Rôle des stérols dans la structuration des membranes plasmiques 2

Figure 5 : Synthèse de l’IPP via la voie MEP 5

Figure 6 : Tronc commun de la biosynthèse des stérols 6

Figure 7 : Schéma de biosynthèse des stérols à partir de l’époxyde de squalène 6

Figure 8 : Métabolisme des stérols 7

Figure 9 : Structure d’une lipoprotéine 8

Figure 10 : Homéostasie du cholestérol chez les Mammifères 9

Figure 11 : Accumulation des esters de stérols dans les stérolosomes 12

Figure 12 : Réaction d’estérification du cholestérol catalysée par acylCoA cholestérol 14
acyltransférases (ACAT) et les lécithine cholestérol acyltransférases
(LCAT)

Figure 13 : Pourcentage d'identité entre les séquences protéiques des LCAT-like 20

Figure 14 : Arbre phylogénétique reliant des protéines apparentées aux LCAT 21

Figure 15 : Alignement entre les séquences de HsLCAT et des 4 LCAT-like 22
d’Arabidopsis thaliana

Figure 16 : Les différents types de phospholipases, sites d’hydrolyse et produits 23
formés

Figure 17 : Dosage des lipides neutres de levures Sc059 transformées 25
pYeDP60-AtLCAT3

Figure 18 : Alignement de séquences nucléotidiques entre AtLCAT3 et un clone de 26
tabac q8487 décrit comme un facteur de transcription chez les plantes
Figure 19 : Dosage des TAG de mutants de levures, affectés dans la biosynthèse 28
des TAG, transformés pYeDP60-AtLCAT3

Figure 20 : Détermination par chromatographie gazeuse de la composition en acides 29
gras des triglycérides de levures Sc062 transformées pYeDP60-AtLCAT3

Figure 21 : Western-blot des protéines des fraction microsomales et du surnageant 30
100 000g de levures Sc062 transformées pYeDP60-AtLCAT3-Flag

Figure 22 : Dosage par chromatographie en phase gazeuse des acides gras libérés dans 32
les fractions acides gras libres (AGL) et lysophosphatidylcholine (LPC)
après incubation de 1-myritoyl, 2-oleyl phosphatidylcholine.

Figure 23 : Pourcentage de la radioactivité libérée par AtLCAT3 dans les fractions 32
acides gras libres (AGL) et lysophosphatidylcholine (lysoPC) après
incubation de diverses phosphatidylcholines radiomarquées

Figure 24 : Détermination de la température optimale de AtLCAT3 : mesure de 33
l’activité spécifique phospholipase A1 en fonction de la température.

Figure 25 : Alignement de séquences peptidiques conservées dans la famille des 34
LCAT animales et des LCAT-like végétales

Figure 26 : Mutation d’acides aminés conservés de AtLCAT3 35

Figure 27 : Détermination de la quantité et de la composition des principaux 39
métabolites lipidiques de la levure Sc062 transformée pYeDP60-AtLCAT3

Figure 28 : Chromatogramme des méthyl-esters d'acides gras libres de la levure Sc062 40
transformée pYeDP60-AtLCAT3

Figure 29 : Incorporation de 14C-acide oléique dans différentes molécules lipidiques 41
dans des levures transformées pYeDP60-AtLCAT3.

Figure 30 : Mesure des activité G3PAT et LPCAT dans des levures Sc062 43
transformées pYeDP60-AtLCAT3 quantifiées par la mesure de la PC
synthétisée

Figure 31 : Détermination de l’activité DGAT en fonction de la concentration 44
d’acylCoA dans les levures Sc062 transformées pYeDP60-AtLCAT3

Figure 32 : Corrélation entre l’accumulation de TAG et activité phospholipase A1 44
dans la levure transformée pYeDP60-AtLCAT3

Figure 33 : Mesure de l’activité phospholipase et de la quantité de TAG de 45
levures Sc062 transformées pVt102U-NtLCAT3

Figure 34 : Dosage des stérols libres et estérifiés de levure Sc062 transformée 46
pYeDP60-AtLCAT3
Figure 35 : Voies de biosynthèse des principales classes de lipides 47

Figure 36 : Récapitulatif des principales enzymes de la biosynthèse des lipides chez 47
la levure

Figure 37 : Expression relative des gènes de la synthèse des lipides chez la levure 47
Sc062 pYeDP60-AtLCAT3 mesurée par PCRq

Figure 38 : Observation microscopiques de levures transformées pYeDP60-AtLCAT3 48

Figure 39 : Mouvements des acides gras entre les principaux pools de lipides chez 50
la levure Sc062 transformée pYeDP60-AtLCAT3

Figure 40 : Mesure de l’expression du transgène 35S::AtLCAT3, de la quantité d’esters 52
de stérols et de TAG dans des transformants primaires de tabac.

Figure 41 : Mesure de l’activité spécifique phospholipase A dans les microsomes de 53
feuillesdes transformants primaires de tabac 35S::AtLCAT3.

Figure 42 : Mesure de l’expression du transgène 35S::AtLCAT3 dans des transformants 53
de tabac de génération T2 par PCR quantitative.

Figure 43 : Mesure de différentes activités acylhydrolases dans les transformants de 54
tabac 35::AtLCAT3 de génération T2

Figure 44 : Détermination de la cinétique d’expression de AtLCAT3 dans différentes 56
conditions de stress physiologique d’Arabidopsis thaliana.

Figure 45 : Dosage des lipides neutres de levures Sc059 transformées 64
pYeDP60-MtLCAT2

Figure 46 : Pourcentage de stimulation de la formation d’esters de stérols en fonction 66
des stérols libres incubés

Figure 47 : Analyse d’Arabidopsis transformés 35S ::AtLCAT2 68

Figure 48 : Quantification des stérols libres et esters d’Arabidopsis transformés 70
35S::AtLCAT2 cultivés en milieu liquide

Figure 49 : Composition stérolique des fractions stérols libres et esters d’Arabidopsis 70
transformés 35S::AtLCAT2 cultivés en milieu liquide

Figure 50 : Quantification des stérols libres et esters d’Arabidopsis transformés 71
35S::AtLCAT2 cultivés en serre

Figure 51 : Composition stérolique de la fraction esters de stérols d’Arabidopsis 71
transformés 35S::AtLCAT2 cultivés en serre

Figure 52 : Quantification des stérols libres et esters d’Arabidopsis transformés 72
35S::AtLCAT2 cultivés sur milieu callogène
Figure 53 : Composition stérolique des fractions stérols libres et esters 73
d’Arabidopsis transformés 35S::AtLCAT2 cultivés sur milieu callogène

Figure 54 : Phénotype d’Arabidopsis transformés 35S::AtLCAT2 cultivés en milieu 74
liquide durant 15 jours en présence de différentes concentration de
mévalolactone.

Figure 55 : Description des lignées de mutants T-DNA dans le gène AtLCAT2 78

Figure 56 : Chromatogrammes de la fraction esters de stérols (saponifiés et acétylés) 79
extraite de mutant d’insertion T-DNA dans AtLCAT2.

Figure 57 : Quantification des stérols libres et esters de mutant AtLCAT2 cultivés 80
en milieu liquide

Figure 58 : Composition stérolique de la fraction esters de stérols de mutants 80
AtLCAT2 cultivés en milieu liquide

Figure 59 : Phénotype d’Arabidopsis mutants AtLCAT2 cultivés en milieu liquide 82
durant 15 jours en présence de mévalolactone 5mM.

Figure 60 : Phénotype d’Arabidopsis mutants AtLCAT2 cultivés en milieu liquide 81
durant 15 jours en présence de différentes concentrations de mévalolactone.

Figure 61 : Phénotype d’Arabidopsis mutants AtLCAT2 cultivés sur milieu solide 82
durant 3 semaines en présence de mévalolactone 5mM.

Figure 62 : Hypothèse sur la régulation de l’estérification des stérols chez 87
Arabidopsis en présence de mévalolactone (MVL)

Figure 63 : Analyse d’Arabidopsis transformés 35S::AtLCAT1 91

Figure 64 : Analyse de tabac transformés 35S ::AtLCAT1 cultivés sur milieu 92
callogène

Figure 65 : Quantité de stérols libres et d’esters de stérols dans des transformants 93
primaires d’Arabidopsis écotype WS transformé 35S::AtLCAT1

Figure 66 : Dosage des stérols de transformants secondaires d’Arabidopsis écotype 94
WS transformé 35S::AtLCAT1

Figure 67 : Dosage des stérols de tabac transformés 35S::AtLCAT1 cultivés sur 95
milieu callogène

Figure 68 : Description de la lignée EQY127 contenant une insertion T-DNA 96
dans le gène AtLCAT1

Figure 69 : Criblage d’un mutant T-DNA homozygote par PCR 97