Table Of ContentĚ
MENDELOVA UNIVERZITA V BRN
AGRONOMICKÁ FAKULTA
Č
DISERTA NÍ PRÁCE
Ř
BRNO 2013 ING. JI Í DOBEŠ
ě
Mendelova univerzita v Brn
Agronomická fakulta
Ústav Chemie a Biochemie
Stanovení biologicky aktivních substancí v rostlinném
materiálu
Disertační práce
Vedoucí práce: Vypracoval:
Prof. RNDr. Bořivoj Klejdus, Ph.D. Ing. Jiří Dobeš
Brno 2013
PROHLÁŠENÍ
Prohlašuji, že jsem disertační práci na téma Stanovení biologicky aktivních substancí
v rostlinném materiálu vypracoval samostatně a použil jen pramenů, které cituji a
uvádím v přiloženém seznamu literatury.
Disertační práce je školním dílem a může být použita ke komerčním účelům jen se
souhlasem vedoucího disertační práce a děkana Agronomické fakulty Mendelovy
univerzity v Brně.
dne 8. 3. 2013
TTaattoo pprrááccee vvzznniikkllaa vv rráámmccii CCEEIITTEECC - Střeeddooeevvrrooppsskkééhhoo tteecchhnnoollooggiicckkééhhoo iinnssttiittuuttuu ss
pppooommmooocccííí vvvýýýzzzkkkuuummmnnnééé iiinnnfffrrraaassstttrrruuukkktttuuurrryyy fffiiinnnaaannncccooovvvaaannnééé ppprrrooojjjeeekkkttteeemmm CCCZZZ...111...000555///111...111...000000///000222...000000666888 z
EEvvrrooppsskkééhhoo ffoonndduu rreeggiioonnáállnnííhhoo rozvoje.
PODĚKOVÁNÍ
Na tomto místě bych rád poděkoval Prof. RNDr. Bořivoji Klejdusovi, Ph.D., Prof. Ing.
Renému Kizekovi, Ph.D., Dr. Ing. Branislavu Ruttkayovi-Nedeckému, Ing. Jiřímu
Sochorovi, Ph.D., Ing. Pavlíně Šobrové a všem ostatním kolegům z laboratoře za pomoc
při zpracování této disertační práce.
ANOTACE
Tato disertační práce je zaměřená na stanovení antioxidantů a antioxidační aktivity. V
první práci byla optimalizována metoda DMPD ke stanovení antioxidační aktivity
standardů antioxidantů a byl sledován průběh reakce v závislosti na čase, koncentraci a
teplotě. Ve druhé práci bylo vyzkoušeno automatizované stanovení antioxidační aktivity
standardů fenolických látek rutinu a kvercitrinu a standardů fenolických kyselin
kyseliny gallové a kyseliny ferulové. Ve třetí práci byl stanoven fenolický profil a
celková antioxidační kapacita (TAC) v meruňkových kultivarech a porovnávána metoda
vysoce účinné kapalinové chromatografie s tandemovou elektrochemickou a UV
spektrometrickou detekcí. Ve čtvrté práci byly popsány elektrochemické metody
používané při stanovení fenolických látek. V páté práci byl sledován oxidační stres
vyvolaný ionty stříbra v bakteriální kultuře Staphylococcus aureus pomocí
spektrofotometrických a elektrochemických metod.
KLÍČOVÁ SLOVA: (antioxidanty, radikály, kvercitrin)
ANNOTATION
This thesis is focused on the determination of antioxidants and antioxidant activity. In
the first work DMPD method was optimized to determine the antioxidant activity of
antioxidants standards and the reaction was monitored depending on the time,
temperature and concentration. In the second work automated determination of
antioxidant activity of phenolic compounds standards rutin, quercitrine and standards of
phenolic acids gallic acid and ferulic acid was tested using five different methods used
in the determination of antioxidant activity using an automated pipetting machines and
spectrophotometer. In the third work phenolic profile and total antioxidant capacity
(TAC) was determined in apricot cultivars with methods high frequency liquid
chromatography with tandemelectrochemical and UV spectrometric detectionand these
two methods were compared. In the fourth work electrochemical methods used for the
determination of phenolic compounds were described.In the fifth work oxidative stress
induced by silver ions in the Staphylococcus aureus bacterial culture was investigated
using spectrophotometric and electrochemical methods.
KEY WORDS: (antioxidants, radicals, quercitrine)
OBSAH
1 ÚVOD.................. ……………………………………………………………………10
2 CÍLE PRÁCE ..... ……………………………………………………………………11
3 LITERÁRNÍ PŘEHLED ..... ………………………………………………………12
3.1 Fenolické látky ........................................................................................................ 12
3.1.1 Anthokyany....................................................................................................... 12
3.1.2 Třísloviny…………. ......................................................................................... 13
3.1.3 Fenolické kyseliny ........................................................................................... 13
3.1.4 Flavonoidy ....................................................................................................... 17
3.1.5 Sirné aminokyseliny ......................................................................................... 19
3.1.6 Vitamíny…………. .......................................................................................... 21
3.2 Radikály……………. ............................................................................................. 25
3.2.1 Reaktivní formy kyslíku…………………………………………………….. 28
3.2.1.1 Metody stanovení reaktivních forem kyslíku…………………………..31
3.3. Antioxidační ochranné mechanismy ..................................................................... 34
3.3.1 Metody stanovení antioxidační aktivity ........................................................... 34
3.3.1.1 Metoda ABTS……………… ................................................................. 34
3.3.1.2 Metoda DPPH……………. .................................................................... 35
3.3.1.3 Metoda DMPD ........................................................................................ 36
3.3.1.4 Metoda FRAP…………. ........................................................................ 36
3.3.1.5 Metoda ORAC… .................................................................................... 36
3.3.1.6 Metody CRO ……………. ..................................................................... 36
5
3.3.1.7 Metoda Free Radicals .............................................................................. 37
3.3.1.8 Metoda TRAP………… ......................................................................... 37
3.3.1.9 Další metody stanovení antioxidační aktivity ......................................... 37
3.4 Metody stanovení antioxidantů ............................................................................... 38
3.4.1 Metody stanovení kyseliny askorbové.............................................................. 38
3.4.2 Metody stanovení kyseliny gallové .................................................................. 41
3.4.3 Metody stanovení kyseliny salicylové .............................................................. 41
3.4.4 Metody stanovení dalších fenolických kyselin ................................................. 42
3.4.5 Metody stanovení rutinu ................................................................................... 43
3.4.6 Metody stanovení kvercitrinu ........................................................................... 43
3.4.7 Metody stanovení L-cysteinu ........................................................................... 44
3.4.8 Metody stanovení D-homocysteinu ................................................................. 46
3.4.9 Metody stanovení N-acetylcysteinu ................................................................. 48
3.4.10 Metody stanovení vitamínu E ........................................................................ 49
4 EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST .................................................................................... 51
4.1 Chemikálie .............................................................................................................. 51
4.1.1 Chemikálie použité pro ruční stanovení antioxidační aktivity ......................... 51
4.1.2 Chemikálie použité pro automatizované stanovení antioxidační aktivity ........ 51
4.2 Příprava reagencií ................................................................................................... 52
4.2.1 Příprava reagencií pro ruční stanovení antioxidační aktivity ........................... 52
4.2.2 Příprava reagencií pro automatizované stanovení antioxidační aktivity .......... 52
4.2.3 Příprava standardů buněčných linií .............................................................. …53
4.2.4 Příprava ředění pro ruční stanovení antioxidační aktivity ................................ 53
4.2.5 Příprava ředění pro automatizované stanovení antioxidační aktivity ............... 53
4.3 Instrumentace …………………………………………………………………….54
4.3.1 Instrumentace pro ruční stanovení antioxidační aktivity .............................. …54
4.3.2 Instrumentace pro automatizované stanovení antioxidační aktivity ............. …55
5 VÝSLEDKY A DISKUSE ......................................................................................... 56
5.1 Metoda DMPD a její výhody a nevýhody .............................................................. 56
5.2 Stanovení antioxidační aktivity pomocí automatického pipetovacího stroje a
automatizovaného spektrofotometru………………………...…………………….74
5.3 Elektrochemické nástroje pro stanovení fenolických sloučenin v rostlinách …….85
5.3.1 Vědecký článek 1…………………………………………...………………..85
5.4 Elektrochemie jako nástroj pro studium antioxidačních vlastností ……………..113
5.4.1 Vědecký článek 2…………………………………………...………............113
5.5 Oxidační stres u bakteriální kultury Staphylocoocus aureus ošetřené ionty stříbra
sledován pomocí spektrometrických a voltametrických metod ………………...143
5.5.1 Vědecký článek 3…………………………………………...……………….143
6 ZÁVĚR……………………………………………………………………………..165
7 POUŽITÁ LITERATURA………………………………………………………..169
8 SEZNAM ZKRATEK……………………………………………………………..197
9 PŘÍLOHY………………………………………………………….........................199
9.1 Seznam obrázků…………………………………………………………………199
9.2 Seznam publikovaných prací……………………………………………………202
1 ÚVOD
Rostliny produkují širokou skupinu sekundárních metabolitů (antioxidantů), které
chrání buňky před oxidačním poškozením. V živočišných buňkách je produkce
antioxidantů omezena [1]. Jsou označovány jako metabolity primární, nebo sekundární.
Jejich úkolem je ochrana rostlin, dodání chuťových a vonných vlastností, dodání barvy
květům a mají významnou funkci při regulaci růstu, vývoji, reprodukci a ochraně rostlin
[2]. Mají vlastnosti antioxidační, antikarcinogenní, antizánětlivé, antiaterosklerotické,
schopnost inhibovat angiogenezi a buněčnou proliferaci. Rovněž mají vliv na vzhled,
chuť, vůni a oxidační stabilitu potravinářských výrobků. Jsou přítomné v zelenině,
ovoci, semenech, čaji, víně, šťávách. Jejich spotřeba je spojována se sníženým rizikem
kardiovaskulárních chorob a některých forem rakoviny. Tyto ochranné účinky souvisí s
jejich antioxidační schopností [3-6]. Mají silný inhibiční účinek na oxidaci indukovanou
peroxylovými radikály [7-10]. Jsou používány v potravinářském, kosmetickém a
farmaceutickém průmyslu jako náhrada za syntetické antioxidanty [11]. Struktura je
klíčovým faktorem jejich antiradikálové činnosti [12]. Do těla se dostávají konzumací
potravin, nápojů a doplňků stravy. Nejvíce fenolických látek v rostlinách je obsaženo v
semenech a slupkách [13], poněvadž jsou důležité při ochraně proti napadení
nejrůznějšími chorobami. Pokud jsou volné fenoly zproštěny glykosidace, mají vyšší
antioxidační účinek. Enzym β-glukosidáza katalyzuje hydrolýzu glykosidické vazby
v alkyl, nebo aryl glykosidech a v glykosidech, které obsahují pouze zbytky sacharidů.
Tento enzym je obvyklý ve všech živých organismech. Je schopen hydrolyzovat
fenolové glykosidy a uvolňuje extrahovatelné aglykony potenciálně s vysokou
antioxidační aktivitou [14-17]. Obecně strava bohatá na ovoce, zeleninu a obiloviny je
spojena s nižším výskytem onemocnění, jako jsou srdeční choroby, některé formy
rakoviny a neurodegenerativní onemocnění [18-24].
10
Description:Tato disertační práce je zaměřená na stanovení antioxidantů a antioxidační aktivity. V první práci byla optimalizována metoda DMPD ke stanovení antioxidační aktivity standardů antioxidantů a byl sledován průběh reakce v závislosti na čase, koncentraci a teplotě. Ve druhé pr
