Différents modes de microscopie appliqués à l'observation des colonies bactériennes dans la ...

26 Pages·2016·5.88 MB·French

Science et Technologie
du Laitet de l’Oeuf
UMR Science et Technologie Du Lait et de l’Œuf
Structuration et mécanismes de déstructuration des matrices alimentaires :de la caractérisation structurale à la digestion
Procédés de l’industrie laitière et fabrication fromagère : vers de systèmes durables
Interactions bactériennes : matrice alimentaire et cellules de l’hôte
Une approche pluridisciplinaire et multi-échelle, renforcée par deux installations d’envergure :
La plateforme Lait Echelle pilote des procédés industriels Un Centre de Ressources Biologique dédié aux Bactéries d’Intérêt Alimentaire
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STLO possède des outils de microscopies : AFM (Microscopie à Force Atomique) et Confocal. 1
http://www6.rennes.inra.fr/stlo
Science et Technologie
du Laitet de l’Oeuf
Différents modes de microscopie
appliqués à
l’observation des colonies bactériennes
dans une matrice alimentaire
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2016-C.Cauty ATELIER MET BIOGENOUEST ROSCOFF
TRANSFORMATION DU LAIT
Ajout de bactéries lactiques
Lait écrémé Lait entier
Lactobacillus bulgaricus,
Streptococcus thermophilus
Fermentation
ECREMAGE
FABRICATION DU
FROMAGE
Yaourts
Ajout de bactéries lactiques et
Fermentation
d’autres micro-organismes
lactique et
coagulation
caillé
Crème Moulage,
égouttage,
salage
Crème fraiche
Affinage
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Fromages
Beurre
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LES COLONIES BACTERIENNES DANS UN GEL LAITIER
Contexte de l’étude :
Les bactéries jouent un rôle dans l’affinage et la flaveur du fromage
et se développent en colonies
Problématique : toutes les molécules ne diffusent pas dans
les colonies
Observations en confocald’une colonie de Lactococcus lactis
immobiliséedans un fromagemodèle
Objectif :
observer l’interface entre colonie de bactéries et la
matrice solide et l’arrangement des bactéries dans
les colonies.
diffusion RITC-dextrande 155kDa diffusion RITC-lactoferrine dans Quels sont les outils et les méthodes développées
à la fois dans la matrice et au sein la matrice mais pas dans la colonie
de la colonie les mieux adaptés pour aborder cet objectif.
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2016-C.Cauty ATELIER MET BIOGENOUEST ROSCOFF
LE LAIT ET LE GEL LAITIER
Application de traitements technologiques sur le lait
87% eau
4,9% lactose (traitement thermique, coagulation)
3,3 - 4,7% matière grasse
3,2 - 3,5% protéines
Fabrication de produits laitiers divers
(différentes microstructures)
Globules gras
(1 – 10 μm)
Micelles de caséines
(50 – 500 nm)
Lait → composé de trois phases :
gel laitier modèle non gras
1 – Phase lipidique sous forme globulaire
2 – Phase protéique dont 80% micelles de caséines et 20% protéines sériques 2-4nm)
3 - Phase aqueuse (eau, protéines solubles, lactose, minéraux, vitamines…) 5
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BIBLIOGRAPHIE SUR GEL LAITIER avec ou sans bactéries
SEM ,Cryo-SEM et Confocal utilisées à l’observation de microstructure de fromages
Cryo-SEM
CONFOCAL  bactéries dans la microstructure de fromage
 Confocal (El-Bakry et al, J Food Eng 2014)
 microstructure pendant la coagulation du lait
 Cryo-Fixation HP et Cryosubstitution
(Ramasubramanian & al. J Food Eng 2013)
 microstructure pendant la fabrication de fromage Cheddar
 Cryo-SEM n’altère pas la microstructure de l’échantillon
(Ong & al. Food Science and Technology 2011)
(a)gel; (b)caillé; Onget al.; 2011
 microstructure de fromage
 SEM mode environnemental ESEM est une alternative (Noronha & al. Food Research International 2008)
 Bactéries Lactococcus Lactis sur Biofilm
 SEM conventionel (Habimana & al. Appl & Env. Microbiology 2009)
Pas d’étude MET-MEB ciblées sur les colonies de bactéries dans les gels laitiers
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STRATEGIE -1
Modèle d’étude : colonies de Lactococcus lactis (coque de diamètre 1 µm) dans un gel laitier modèle non gras
Stratégie : observer des colonies de taille comparable avec celles dans le fromage , en intégrant les
contraintes liées aux outils d’observation.
La taille des colonies et leur distance est modulée par le niveau d’inoculation
107 colonies/cm3 106 colonies/cm3
Grosses colonies rondes
petites colonies
(Des centaines de
(environ 50 bactéries)
bactéries )
En MET En MEB
PLATEFORME Mric-MET Rennes PLATEFORME GENOTOUL Toulouse
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S. Jeanson & al Spatial Distribution of BacterialColonies in a Model Cheese, Applied and Environmental Microbiology, 2011
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STRATEGIE -2
Technique de préparation du gel laitier
Mélange chambre d’observation Couler le mélange prise du gel à l’étuve Avec lame de rasoir Démouler le gel
Lait et avec cupules or de 1,5mm Retirer l’aclar Pour récupérer coupelle
Diamètre et 200µm épaisseur
présure
En MET En MEB
CRYO-FIXATION HP
Cryo-MEB
Conventionnel
cryofracture
topographie tomographie Cryo-MEB Environemental
Cryocoupe
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LES OUTILS MET SUR LA PLATEFORME Mric-MET Rennes
FEI TecnaïG2 Sphera LaB6 200 kV
JEOL JEM 1400 tungsten120 kV
topographie tomographie
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MODE de CRYO-FIXATION HP et CRYOSUBSTITUTION
Cryo-fixation Haute-Pression (HP)
Cryo-substitution
LeicaEM PACT II
LeicaEM AFS2
0,5mm
0,5mm
Inclusion résine épon
à basse temperature
Coupes 90 nm
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