Développement de sondes moléculaires appliquées à l'étude de la biosynthèse des flavonoïdes

229 Pages·2016·8.11 MB·French

by  Hélène Carrié

Développement de sondes moléculaires appliquées à
l’étude de la biosynthèse des flavonoïdes
Hélène Carrié
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Hélène Carrié. Développement de sondes moléculaires appliquées à l’étude de la biosynthèse des
flavonoïdes. Autre. Université Sciences et Technologies - Bordeaux I, 2013. Français. ￿NNT:
2013BOR15012￿. ￿tel-01124168￿
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N° d’ordre : 5012

THÈSE

PRÉSENTÉE A

L’UNIVERSITÉ BORDEAUX 1

ÉCOLE DOCTORALE DES SCIENCES CHIMIQUES

Par Hélène CARRIÉ

POUR OBTENIR LE GRADE DE

DOCTEUR
SPÉCIALITÉ : CHIMIE ORGANIQUE

DÉVELOPPEMENT DE SONDES MOLÉCULAIRES
APPLIQUÉES À L’ÉTUDE DE LA BIOSYNTHÈSE DES
FLAVONOÏDES

Directeurs de recherche : Pr Stéphane Quideau et Dr Denis Deffieux

Soutenue le : 20 Décembre 2013

Devant la commission d’examen formée de :
M. ANTONCZAK, Serge Professeur, Université de Nice Rapporteur
M. MATEUS, Nuno Professeur, Université de Porto Rapporteur
Mme GENY, Laurence Maître de conférences, Université Bordeaux 2 Examinateur
M. SCHMITTER, Jean-Marie Professeur, Université Bordeaux 1 Président
M. DEFFIEUX, Denis Maître de conférences, Université Bordeaux 1 Co-directeur de thèse
M. QUIDEAU, Stéphane Professeur, Université Bordeaux 1 Directeur de thèse
M. CHARLIER, Laurent Chargé d’étude, CIVB Bordeaux Invité
Université Bordeaux 1
Les Sciences et les Technologies au service de l’Homme et de l’environnement

Remerciements

Je tiens tout d’abord à remercier le Professeur Stéphane Quideau pour m’avoir
accueillie au sein de son équipe à l’Institut Européen de Chimie et Biologie (IECB) de Pessac,
pour m’avoir encadrée tout au long de ces trois années, pour avoir été patient avec moi et
m’avoir fait confiance tout au long de ces trois années de thèse. « Allez ! Retourne travailler, ne
lâche rien ! Croque dans ton sujet !»

Je souhaite également témoigner ma reconnaissance au Docteur Denis Deffieux pour
son implication, ses conseils avisés et son soutien dans ces travaux.

J’adresse mes sincères remerciements aux Professeurs Serge Antonczak et Nuno
Mateus pour avoir accepté de juger ce travail en qualité de rapporteurs.

Je tiens également à remercier le Conseil Interprofessionnel du Vin de Bordeaux
(CIVB) d’avoir financé ma thèse et ce projet.

Je souhaite témoigner ma gratitude à Sabrina Rousseau pour ses conseils, ses
encouragements, sa disponibilité et sa très précieuse aide en biologie : merci d’avoir été bien
plus qu’une collègue tout au long de ce travail. Je tiens également à adresser mes
remerciements à Laurence Geny, Annie L’Hyvernay et Céline Chollet de l’Institut des
Sciences de la Vigne et du Vin (ISVV) qui nous ont fourni les matières premières
indispensables à ce travail, à Stéphane Chaignepain pour son aide, son écoute et les analyses
MALDI, merci d’avoir pris de ton temps pour mon travail, à Stéphane Claverol et Anne-
Marie Lomenech de l’Université Bordeaux 2 pour les analyses par spectrométrie de masse, à
Axelle Grélard et Yannick Chollet pour leurs conseils sur les études RMN et à Brice
Kauffmann pour les caractérisations par diffraction des rayons X.

Un remerciement spécial à mes collègues chimistes et tout d’abord à Emilie, Cyril et
Romain, trois compagnons d’ « aventure », on y est arrivé \o/ good job team !!! Tienichou, la
petite touche exotique qui a fait des miracles, Mourad alias « la mouette » et Simon, bon
courage pour la suite les gars !, Gloria, Rémi, Philippe, Claire, Juliette, aux anciennes
doctorantes polyphénolistes Sophie et Céline (merci pour tout le travail que vous avez
fait !!!), Audinette la cacahuète et Mélanie (Rock your reactions ! Merci pour le soutien,
l’écoute, les conseils … miss you !!!), à mes collègues biologistes Natacha, Amélie et tout
particulièrement à Julia, « l’œil du chat » et à charge de revanche, ainsi qu’à mes stagiaires
Julie, Pauline et Laetitia.

3
Remerciements

Je tenais également à remercier les personnes qui m’ont aidée, chacunes à leur
manière, tout au long de ma thèse : Françoise, merci pour m’avoir permise de rester optimiste,
Jean-Hugues, même à plus de 600 km merci d’être resté disponible, Christian J. pour les
échanges et les conseils, Sébastien, Aurélie mon petit basilic, Morgane et Joanny pour les
week ends détente bien mérités qui ont été de vraies bulles d’oxygène, mes parents et ma
famille et tout particulièrement mon grand père.
Enfin, j’adresse mes plus sincères remerciements à Bernard, pour son aide et son
soutien tout au long de cette thèse et surtout dans les moments les plus critiques, pour son
calme, sa compréhension et sa patience infinie. Merci d’avoir su me supporter et me gérer au
quotidien.

4
Remerciements 3
...........................................................................................................................
Liste des abbréviations .............................................................................................................. 10
Introduction générale .............................................................................. 17

CHAPITRE 1 : Introduction bibliographique ................................... 20

I. Généralité sur Vitis ....................................................................................................... 21
1. Généralités ............................................................................................................. 21
2. Développement de la vigne et du raisin ................................................................. 22
a. Développement de la vigne ................................................................................ 22
b. Suivi de l’évolution de la maturité du raisin – stades phénologiques du raisin . 23
3. Evaluation de la maturité des baies ........................................................................ 25
II. Généralités sur les flavonoïdes ..................................................................................... 28
1. Etude structurale .................................................................................................... 28
2. Principaux flavonoïdes chez Vitis ......................................................................... 29
a. Les flavonols ...................................................................................................... 30
b. Les flavan-3-ols .................................................................................................. 30
c. Les anthocyanes ................................................................................................. 31
d. Les proanthocyanidines ...................................................................................... 31
3. Biosynthèse conduisant aux anthocyanes et proanthocyanidines .......................... 33
a. Premières étapes conduisant aux leucoanthocyanidines .................................... 33
b. Formation des anthocyanes ................................................................................ 34
c. Formation des flavan-3-ols ................................................................................. 38
d. Accès biosynthétique aux proanthocyanidines ou tannins condensés ............... 39
III. Objectif et stratégie .................................................................................................... 39
1. Contexte et techniques disponibles ........................................................................ 39
a. L’analyse génomique ......................................................................................... 40
b. L’analyse protéomique ....................................................................................... 40
5
2. Description de l’analyse protéomique ................................................................... 41
a. Principe de l’analyse « Bottom-up » .................................................................. 41
b. Analyse sans séparation préalable des protéines ou analyse par « Shotgun » ... 44
3. La protéomique appliquée à l’étude des protéomes de Vitis vinifera .................... 45
4. Protéomique chimique ........................................................................................... 48
a. Travaux précédents : colonnes d’affinité, avantages et inconvénients .............. 48
b. L’ABPP : description de la technique et applications ........................................ 52
c. Schéma général des sondes ABPP ..................................................................... 52
d. Principe des sondes ABPP ................................................................................. 53
CHAPITRE 2 : Développement de sondes activables par oxydation
chimique : sondes A ................................................................................. 58

I. Bibliographie ................................................................................................................ 59
1. Oxydation des flavanols et interactions avec les nucléophiles .............................. 59
2. Les sondes activables par oxydation dans la littérature ......................................... 63
II. Synthèse ....................................................................................................................... 66
1. Modification des substrats flavonoïques ................................................................ 67
a. Synthèse de la catéchine et de l’épicatéchine modifiées .................................... 68
b. Synthèse de la leucocyanidine modifiée ............................................................ 71
2. Synthèse des sondes A et A ................................................................................. 76
1 2
III. Etudes de capture en conditions oxydantes ............................................................... 77
1. Etudes de capture sur molécules modèles .............................................................. 77
a. Etude de la formation d’adduits entre la catéchine et la Fmoc-cystéine (57) par
RMN ............................................................................................................................ 77
b. Etude de la formation d’adduits entre la sonde A et des molécules modèles par
1
spectrométrie de masse ................................................................................................. 79
2. Validation des sondes à l’aide d’une protéine de la voie de biosynthèse des
flavonoïdes : la LDOX ..................................................................................................... 84
a. Tests de capture .................................................................................................. 85
6
b. Calcul du rendement de capture ......................................................................... 88
c. Western Blot ....................................................................................................... 90
3. Etude de la sélectivité des sondes A ...................................................................... 92
4. Visualisation du site de fixation de la sonde sur la LDOX .................................... 94
a. Etude de la fixation de la sonde sur la LDOX : visualisation du complexe
sonde/LDOX. ............................................................................................................... 94
b. Etude de la fixation de la sonde sur la LDOX : recherche de peptide porteur de
la sonde ......................................................................................................................... 96
IV. Conclusion ................................................................................................................. 98
CHAPITRE 3 : Développement de sondes photoactivables : sondes
B ................................................................................................................ 100

I. Bibliographie .............................................................................................................. 101
1. Groupements photoactivables .............................................................................. 101
a. Différents groupements photoactivables disponibles ....................................... 102
b. Les azotures aromatiques en détail ................................................................... 105
2. Utilisation pour la capture de protéines ............................................................... 106
II. Synthèse ..................................................................................................................... 108
1. Synthèse de la fonction réactive .......................................................................... 108
2. Synthèse des sondes B et B ............................................................................... 109
1 2
a. Synthèse autour de la S-benzyl-cystéine .......................................................... 109
b. Synthèse autour de la cystine ........................................................................... 110
3. Activation de l’azoture ......................................................................................... 118
a. Rappel sur la fonction réactive ......................................................................... 118
b. Spectres d’absorption UV de la sonde B et suivi d’irradiation ....................... 118
1
III. Application à la capture de la LDOX ...................................................................... 120
1. Stabilité de la LDOX dans les conditions d’activation de l’azoture .................... 121
2. Etude comparative de capture de la LDOX par les sondes A et B ...................... 122
a. Premier essai .................................................................................................... 122
7
b. Deuxième essai ................................................................................................. 123
c. Dernier essai de capture ................................................................................... 124
d. Etude de capture sur un mélange LDOX/BSA ................................................. 125
IV. Conclusion ............................................................................................................... 126
CHAPITRE 4 : Application de la stratégie à des mélanges
complexes de protéines ......................................................................... 128

I. Préparation des extraits protéiques ............................................................................. 129
1. De la pellicule aux extraits de protéines .............................................................. 129
a. Description générale de la baie et composition de la pellicule du raisin ......... 129
b. Description de la cellule végétale ..................................................................... 130
c. Extraction des protéines du matériel végétal .................................................... 131
2. Mise au point d’un protocole efficace et non dénaturant pour l’extraction des
protéines issues de baies de raisin de la variété Cabernet Sauvignon ............................ 134
a. Détermination de la base du tampon utilisé ..................................................... 134
b. Optimisation de l’extraction ............................................................................. 137
c. Application du protocole d’extraction à différents stade de développement ... 140
II. Application des sondes A aux extraits issus de Vitis vinifera .................................... 142
1. Protocole de capture ............................................................................................. 142
2. Résultats des captures .......................................................................................... 143
a. Floraison ........................................................................................................... 145
b. Nouaison ........................................................................................................... 146
c. Début véraison .................................................................................................. 147
d. Fin véraison ...................................................................................................... 148
III. Conclusion ............................................................................................................... 149
Conclusion et perspectives ................................................................... 151

CHAPITE 5 : Partie expérimentale ................................................... 155

I. General ....................................................................................................................... 156
8
1. General experimental conditions ......................................................................... 156
a. Solvents and experimental conditions ............................................................. 156
b. TLC .................................................................................................................. 156
2. Technical analysis ................................................................................................ 157
a. Melting poins (m.p.) ......................................................................................... 157
b. Infrared Spectroscopy (IR) ............................................................................... 157
c. Nuclear Magnetic Resonance (NMR) .............................................................. 157
d. Mass Spectrometry (MS) ................................................................................. 158
II. Synthesis of A ring modified flavanols ...................................................................... 159
1. Synthesis of A ring modified (2R,3S)-catechin and (2R,3R)-epicatechin ........... 159
2. Synthesis of A ring modified (2R,3S,4S)-leucocyanidin ..................................... 172
III. Synthesis of probes A and B.................................................................................... 179
1. Synthesis of probes A and A ............................................................................. 179
1 2
2. Synthesis of the reactive function ........................................................................ 184
3. Synthesis of probes B and B ............................................................................. 188
1 2
IV. Capture experiments with probe A and model molecules ...................................... 204
1
1. General ................................................................................................................. 204
2. Stainings ............................................................................................................... 204
3. Experimental protocol .......................................................................................... 205
4. LC-MS analysis ................................................................................................... 205
5. MALDI ................................................................................................................ 206
V. Assays on LDOX enzyme .......................................................................................... 206
1. Production and purification of recombinant LDOX ............................................ 206
2. LDOX enzyme assays .......................................................................................... 207
3. Capture protocol ................................................................................................... 207
a. Buffers preparation ........................................................................................... 207
b. Probes A and A .............................................................................................. 208
1 2
9