Development of selective fluorescent imaging agents for neurofibrillary tangles in Alzheimer's ...

245 Pages·2013·25.95 MB·English

Development of selective fluorescent
imaging agents for neurofibrillary tangles
in Alzheimer’s diagnosis

Vom Fachbereich Chemie
der Technischen Universität Darmstadt

zur Erlangung des akademischen Grades eines
Doctor rerum naturalium (Dr. rer. nat.)

genehmigte

kumulative Dissertation

vorgelegt von

Upendra Rao Anumala, M.Sc.
aus Nelakondapally (Indien)

Referent: Prof. Dr. Boris Schmidt

Korreferenten: Prof. Dr. Harald Kolmar

Tag der Einreichung: 25. Juli 2013

Tag der mündlichen Prüfung: 07. Oktober 2013

Darmstadt (2013)

D17
The present work was performed under the supervision of Prof. Dr. Boris Schmidt at the
Clemens Schöpf-Institute of Organic Chemistry and Biochemistry of the Technische
Universität Darmstadt from February 2010 to June 2013.
To my mother

Acknowledgements

The work embodied in this thesis was carried out from February 2010 to June 2013 at the
Clemens Schöpf-Institute of Organic Chemistry and Biochemistry of the Technische
Universität Darmstadt. These three years that I had been through was truly once in a life time
experience. I realize there are many people who deserve to be thanked for what I have
become now.

First and foremost, I would like to express my sincere gratitude to my supervisor and guide,
Prof. Dr. Boris Schmidt, for his continuous support and helpful guidance. I indeed consider it
an honor to have worked under such a renowned scientist in the field of Alzheimer’s
research. His simplicity, enthusiasm and passion towards research has inspired and
motivated me in my work at each and every step of my tenure at Technische Universität
Darmstadt (TUD). Discussions with him have always given me invaluable insights into my
work.

Secondly, I owe my thanks to several people at our Institute of Organic Chemistry at the TUD
for contributing towards my successful research and eventful life in Darmstadt. Our group
secretary Birgit, fellow lab-mates, namely Daniel, Andrea, Constantin, Christoph, Stefan,
Binia, and Eva helped me during my days at the institute to get myself quickly accustomed to
the life at TUD. My co-researchers, namely Jiamin, Fabio, Thomas, Marlyse, Stephanie and
Azadeh played a significant role in terms of chemistry and non-chemistry discussions, help
with German language, and not-to-forget a great friendship. Big thanks to all of you. Several
bachelor students at the institute, namely Alex, Kai, and Dennis, too made valuable
contributions towards my research through their thesis works. I would like to thank all these
people for their help and positive influence in my work.

Thirdly, my work would not have been accomplished if not for the kind cooperation from
various collaborating institutes, research groups, and companies. I would like to thank
Prof. Dr. Adrian Palacios, Dr. Christian Czech, Prof. Dr. Eckhard Mandelkow, Prof. Dr. Ingrid
Hilger, Prof. Dr. Jochen Herms, Dr. Martin Fuhrmann, Prof. Dr. Robert Berger, Dr. Roland
Heyny von Hauβen, Christian Schön, Jana Hoelzer and Valeria Goetschy for their
collaborations with respect to analysis and testing of my compounds. Thanks go to research
groups of Prof. Dencher and Prof. Schmitz for their kind cooperation during ultra-violet and
fluorescence emission experiments.

I also would like to thank to Prof. Dr. Harald Kolmar, Prof. Dr. Barbara Albert and PD. Dr.
Stefan Immel for being in my Ph.D. committee.

Besides work life, Darmstadt gave me several moments and friendships to cherish about. I
have made a lot of friends through cricket matches and the Darmstadt Indian Association. I
take this opportunity to thank all these friends, for example Pritam, Mani, Titu, Murthy, Uday,
Jagan, Prashant, Rajesh, Subramanyam, Timir, Parul and Shamsiyah for making Darmstadt
my new home away from my home in India.

I am deepely grateful to colleagues at my previous workplaces, Dr. Steven Ball, Dr. Praveen
Cherukupally, Mr. Sahadev Katam, Dr. Ramulu Akula, Dr. Raj Narlawar and all my masters’
classmates for their encouragement.

I wish to acknowledge the financial support for this work from the Federal German
government and Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF).

Last but not least, I owe my heartfelt gratitude to my family members, Mrs. Janaki Anumala,
Mr. Ravindranath Anumala, Mrs. Rajani Anumala and Mr. Umashankar Vangaveti and
Mrs. Anitha Vangaveti, for their love and continuous encouragement.
Partial results of this thesis have been accepted or submitted for publication:

1. Fabio Lo Monte, Thomas Kramer, Jiamin Gu, endra ao Anumala uciana
arinelli aleria a ietra ttore o ellino n dicte ranco a id emedts red
Van Leuven, Ana Fuertes, Juan Manuel Dominguez, Batya Plotkin, Hagit Eldar-
Finkelman, Boris Schmidt. Identification of Glycogen Synthase Kinase-3 Inhibitors
with a Selective Sting for Glycogen Synthase Kinase-3α, Journal of Medicinal
Chemistry, 2012, 55, 4407-4424.

2. Jiamin Gu, Upendra Rao Anumala, Fabio Lo Monte, Thomas Kramer, Roland Heyny
von Haußen, Jana Hölzer, Valérie Goetschy-Meyer, Gerhard Mall, Ingrid Hilger,
Christian Czech, Boris Schmidt. 2-Styrylindolium based fluorescent probes visualize
neurofibrillary tangles in Alzheimer’s disease. Bioorganic & Medicinal Chemistry
Letters 2012, 22, 7667-7671.

3. Jiamin Gu, Upendra Rao Anumala, Roland Heyny von Haußen, Jana Hölzer, Valérie
Goetschy-Meyer, Gerhard Mall, Ingrid Hilger, Christian Czech, Boris Schmidt. Design,
synthesis and biological evaluation of trimethine cyanine dyes as fluorescent probes
for the detection of tau fibrils in Alzheimer’s disease brain and olfactory e ithelium.
ChemMedChem 2013, 8, 891-897.

4. Upendra Rao Anumala, Jiamin Gu, Fabio Lo Monte, Thomas Kramer, Roland Heyny
von Haußen, Jana Hölzer, Valérie Goetschy-Meyer, Christian Schön, Gerhard Mall,
Ingrid Hilger, Christian Czech, Jochen Herms, Boris Schmidt. Fluorescent rhodanine-
3-acetic acids visualize neurofibrillary tangles in Alzheimer’s disease brains.
(Accepted in Bioorganic & Medicinal Chemistry. doi: 10.1016/j.bmc.2013.06.039)
Zusammenfassung
Die Alzheimer-Krankheit ist eine langsam fortschreitende neurodegenerative Form der
Demenz. Die Anzahl an Neuerkrankungen steigt Jahr für Jahr. Derzeit sind mehr als 25
Millionen Menschen betroffen. Schätzungen zufolge wird die Anzahl an betroffenen
Patienten bis 2030 auf 63 Millionen ansteigen. Gedächtnisstörungen, Gemütsschwankungen
sowie Probleme mit dem Sprechen und Schreiben charakterisieren den Verlauf dieser
Krankheit. Derzeitige diagnostische Methoden sind oft ungenau und können nicht
hinreichend zwischen der Alzheimer-Krankheit und anderen Formen der Demenz
unterscheiden. Die Alzheimer-Krankheit ist auf zwei verschiedene Proteinablagerungen
zurückzuführen: Senile Plaques (SPs) und neurofibrilläre Bündel (NFTs). Die Bildung der
Senilen Plaques ist auf die Aggregation des unlöslichen amyloid Vorläuferproteins (APP)
zurückzuführen, wohingegen die NFTs durch die Aggregation von hyperphophorylierten Tau
entstehen.

Es ist möglich SPs und NFTs bildlich darzustellen. Angewandte Techniken sind hierbei die
Positronen-Emissions-Tomographie oder die Fluoreszenz Spektroskopie, welche auch eine
frühe Diagnose der Alzheimer-Krankheit ermöglicht. Obwohl die Visualisierung der SPs
bereits bekannt ist, korrelieren diese nicht mit der Krankheit, da SPs ebenfalls in Gehirnen
gesunder Patienten gefunden werden. Deswegen ist eine Diagnose der Alzheimer-Krankheit,
welche ausschließlich auf SPs Visualisierung beruht, sehr ungenau. Im Gegensatz dazu
stehen die NFTs mit der Entstehung der Alzheimer-Krankheit in Beziehung und deshalb
kann die Fluoreszenz-Bildgebung als Methode den fortschreitenden Verlauf aufzeigen.

Die vorliegende Arbeit zeigt eine Reihe von Verbindungen, welche SPs und NFTs auf
Gehirnschnitten visualisiert. Unterschiedliche Klassen von Verbindungen wurden hierbei
synthetisiert und auf ihre Fähigkeit als Marker für die NFTs untersucht. Hierbei waren vor
allem die Derivate von Rhodanin-3-essigsäure sowie Bis(arylvinyl)pyrazin- und 5H-
Imidazo[4,5-c]pyridin Derivate aussichtsvolle Verbindungen für die Tau-Bildgebung. Unsere
Untersuchungen mit diesen Verbindungen zeigte uns, dass diese Verbindungen an NFTs in
Gehirnen binden, was durch Fluoreszenz-Mikroskopie deutlich gemacht wurde. Zusätzlich
dazu wurden ausgewählte Verbindungen auf ihre Zytotoxizität in einem hepatozellulären
Karzinom-Assay und in einem Zebrafisch-Toxizitäts-Assay getestet. Diese Experimente
zeigten, dass die untersuchten Verbindungen keine oder nur geringfügige Zytotoxizität
aufwiesen. Des Weiteren zeigten in vitro Studien der Derivate von Rhodanin-3-essigsäure in
P301S Mäuse-Retina und in vitro Experimente in menschlicher Alzheimer-Retina das
Ausbleiben des Färbens des Retinagewebes. Das Anfärben mit dem Antikörper AT8 zeigte
hingegen positive Ergebnisse. Dieses machte deutlich, dass Tau-Aggregate der Retina
P301S Maus unterschiedlich zu der menschlichen Form des Tau-Aggregats sind. Weiterhin
wurden in vitro Experimente mit Verbindungen von 5H-Imidazo[4,5-c]pyridin an
olfaktorischen Epithelgewebe durchgeführt. Die Ergebnisse zeigten, dass diese
Verbindungsklasse Tau-Ablagerungen anfärbte.
Abbreviations

Å Angstrom FEOAD familial early-onset
Aβ β-amyloid Alzheimer’s disease
AD Alzheimer's disease fMRI functional magnetic
ADDLs amyloid beta diffusible resonance imaging
ligands FTD fronto temporal dementia
ADME absorption, distribution, GSK-3 glycogen synthase kinase-3
metabolism and elimination h hour
AICD APP intracellular domain HepG2 hepatocellular carcinoma
Ala alanine cell lines
Arg arginine HMGR hydroxmethylglutaryl-CoA
Asp asparagine reductase
ApoE apolipoprotein E HPLC high performance liquid
APP amyloid precursor protein chromatography
aq. aqueous HTS high throughput screening
Ar aryl Hz hertz
A2M alpha 2-macroglobulin IC the half maximal inhibitory
50
BACE β-site APP cleavage concentration
enzyme ICD intracellular domain
BBB blood brain barrier IDE insulin degrading enzyme
BINAP 2,2'-bis(diphenylphosphino) IR infra-red
-1,1'-binaphthyl Ki binding affinity
Bn benzyl K2CO3 potassium carbonate
BP benzophenone tBuONa sodium tertiary butoxide
Boc tert-butoxy carbonyl tBuOK potassium tertiary butoxide
cat. catalytic LRP LDL receptor related protein
M+ molecular ion (molecular
CDK5 cyclin-dependent kinase 5
CNS central nervous system mass)
Conc concentration MCI mild cognitive impairment
MD mixed dementia
CR congo red
CSF cerebrospinal fluid Me methyl
CT computerized tomography MEG magneto encephalography
MgSO magnesium sulphate
DCM dichloromethane 4
MHz mega Hertz
DAST diethylaminosulfur trifluoride
mp melting point
DLB dementia with lewis bodies
DMF N,N'-dimethyl formamide MRI magnetic resonance
imaging
DMSO dimethyl sulfoxide
MS mass spectroscopy
DOI diffuse optical imaging
EC concentration required for NaCl sodium chloride
50
NaH sodium hydride
obtaining 50% of the
NaN sodium azide
maximum response 3
Na SO sodium sulfate
EGFP enhanced green fluorescent 2 4
NFT neurofibrillary tangle
protein
EI electron impact NGF nerve growth factor
eq. equivalents NH4Cl ammonium chloride
NMR nuclear magnetic
EROS event-related optical signal
ESI-MS electron spray ionization resonance
NPH normal pressure
mass spectrometry
Et ethyl hydrocephalus
Et N triethylamine NSAIDs non-steroidal anti-
3
EtOAc ethyl acetate inflammatory drugs
FAD familial Alzheimer’s disease NTF N-terminal fragment