development of molecular systems for the detection of environmental arsenic

136 Pages·2016·6.22 MB·English

by  Giovanni Sanni

DDEEVVEELLOOPPMMEENNTT OOFF MMOOLLEECCUULLAARR
SSYYSSTTEEMMSS FFOORR TTHHEE DDEETTEECCTTIIOONN OOFF
EENNVVIIRROONNMMEENNTTAALL AARRSSEENNIICC

Immacolata Antonucci

Dottorato in Scienze Biotecnologiche – 28° ciclo
Indirizzo Biotecnologie Industriali e Molecolari
Università di Napoli Federico II

Dottorato in Scienze Biotecnologiche – 28° ciclo
Indirizzo Biotecnologie Industriali e Molecolari
Università di Napoli Federico II

DDEEVVEELLOOPPMMEENNTT OOFF MMOOLLEECCUULLAARR
SSYYSSTTEEMMSS FFOORR TTHHEE DDEETTEECCTTIIOONN OOFF
EENNVVIIRROONNMMEENNTTAALL AARRSSEENNIICC

Immacolata Antonucci

Dottoranda: Immacolata Antonucci

Relatore: Prof.ssa Simonetta Bartolucci

Coordinatore: Prof. Giovanni Sannia

“To strive, to seek,
to find, and not to yield”

From “Ulysses”
Alfred Tennyson

CONTENTS

Riassunto pag. 1

Summary pag. 6

Chapter 1 General introduction pag. 7

Chapter 2 Characterization of the arsenic resistance mechanism pag. 28
in Thermus thermophilus

2.1 An ArsR/SmtB family member involved in the pag. 30
regulation of arsenic resistance genes in Thermus
thermophilus HB27

2.2 A pull-down assay for the identification of TtSmtB pag. 49
molecular interactors

2.3 TtSmtB expression in Thermus thermophilus HB27 pag. 55

Chapter 3 Development of biosensors for the detection of pag. 59
environmental arsenic

3.1 A novel Thermus thermophilus whole-cell biosensor pag. 61
for the detection of arsenic pollution

3.2 Development of an Arsenate Nanobiosensor based pag. 72
on the TtArsC arsenate reductase activity to detect
arsenic pollution

Chapter 4 Isolation and identification of a new thermophilic pag. 82
arsenic resistant microorganism

Chapter 5 General conclusions pag. 92

Appendix I List of communications and publications pag. 98

Appendix II Experiences in foreign laboratories pag. 99

Appendix III pag. 100

Riassunto
RIASSUNTO

I metalli pesanti sono la causa di uno dei più gravi problemi di inquinamento del
nostro tempo. Anche se in piccole concentrazioni, minacciano la salute umana e
l’ambiente perché non sono biodegradabili. Le persone sono sempre state esposte ai
metalli pesanti nell'ambiente (elementi metallici di pesticidi e agenti terapeutici,
contaminazione metallica di cibo e acqua, etc.), soprattutto negli ultimi anni, con
l'impiego dei metalli nelle applicazioni industriali; l'inquinamento causato dai metalli
pesanti è anche legato alla combustione di materiale plastico, prodotti in PVC,
scarichi di automobili, fumo di sigarette, batterie e rifiuti urbani. Pertanto, è
importante essere informati circa le concentrazioni di metalli pesanti ed adottare
misure di protezione contro la sovraesposizione. Attualmente, tra i vari inquinanti
diffusi in massa nell'ambiente, i metalli pesanti sono tra i composti più nocivi; i gruppi
sulfidrilici (SH), che normalmente si trovano negli enzimi si legano facilmente ai
metalli pesanti, ed il risultante complesso metallo-zolfo inattiva l’enzima.
La tossicità dei metalli pesanti può provocare un danneggiamento o una riduzione
della funzione del sistema nervoso centrale, danni alla composizione del sangue, ai
polmoni, ai reni, al fegato e ad altri organi vitali. L'esposizione a lungo termine può
portare a lenta progressione di processi degenerativi fisici, muscolari e neurologici
che imitano il morbo di Alzheimer, il morbo di Parkinson, la distrofia muscolare, e la
sclerosi multipla. Il ripetuto contatto a lungo termine con alcuni metalli o loro
composti può anche causare il cancro (International Occupational Safety and
Information Centre Salute, 1999).
Pertanto, è chiaro che il controllo dell'inquinamento delle acque e dei suoli,
principalmente vicino a zone industriali o a zone contaminate, è uno dei principali
obiettivi ambientali. Diversi metodi chimici sono stati sviluppati per quantificare i
metalli pesanti e cercare di ridurre la loro concentrazione in siti inquinati, ma il
problema persiste vista la necessità di smaltire i rifiuti trattati e ogni, probabilmente
anche più tossico, sottoprodotto chimico; così tenendo conto dei progressi delle
biotecnologie, sarebbe interessante cercare di sviluppare un biosensore batterico o
una tecnica di bonifica a base biologica.
I biosensori sono costituiti da un “elemento biologico” che riconosce il composto di
interesse dando luogo ad un fenomeno chimico o chimico fisico; la loro
classificazione avviene in base alla biomolecola di riconoscimento, ad esempio
biosensori enzimatici a biosensori a cellule.
Un biosensore può essere utilizzato come metodo rapido e sensibile per rilevare e
quantificare specie tossiche; i biosensori si basano sull'analisi dell'espressione di un
gene reporter che è controllato da un promotore sensibile ad un particolare composto
tossico. L'uso di biosensori come sistema di monitoraggio ambientale ha diversi
vantaggi, tra cui specificità, velocità, portabilità, facilità d'uso, la segnalazione in
tempo reale e, inoltre, consente misurazioni tossicologiche. D'altra parte, la
bioremediation sfrutta la versatilità metabolica dei microrganismi per degradare
inquinanti pericolosi, per cui i microrganismi potrebbero essere stimolati o
appositamente sviluppati per degradare/trasformare una sostanza tossica in prodotti
non tossici, o ridurre le concentrazioni a livelli bassi anche direttamente nel sito
inquinato.
La grande diversità genetica dei microrganismi spiega la loro grande versatilità
metabolica. Inoltre, la loro abbondanza, i loro tassi di crescita elevati e la loro
suscettibilità ad acquisire geni attraverso il trasferimento genico orizzontale, permette
loro di evolvere rapidamente e di adattarsi alle mutevoli condizioni dell'ambiente,
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Riassunto
anche per ambienti estremi che non permettono la proliferazione di altri organismi
viventi. I microrganismi hanno una grande varietà di meccanismi di difesa contro i
metalli presenti nell'ambiente naturale e hanno sviluppato sistemi basati su regolatori
trascrizionali metallo-sensori che regolano la trascrizione di geni che codificano
proteine responsabili della disintossicazione dal metallo, del sequestro, dell’efflusso
e dell'assorbimento.
I microrganismi che mostrano tali caratteristiche possono essere un punto di
partenza per la costruzione di biosensori per il monitoraggio dell'inquinamento
ambientale. La costruzione di un biosensore richiede, da un lato, lo studio della
biochimica alla base della tolleranza dell’inquinante da parte dalla cellula, e dall'altro,
un sistema genetico facilmente gestibile. Il ceppo ricombinante potrebbe essere
rappresentato da un sistema genetico costituito da un promotore inducibile, sensibile
a composti tossici, fuso ad un gene reporter che codifica una proteina facilmente
rilevabile. Una varietà di promotori ben caratterizzati è disponibile per le
manipolazioni genetiche (promotori di vari metalli pesanti, aldeidi aromatiche,
idrocarburi, pesticidi, salicilati, etc.). I geni reporter più comunemente usati sono:
lacZ, che codifica la β-galattosidasi, la cui attività enzimatica può essere determinata
da una reazione colorimetrica; il gene della luciferasi (gene lux) o il gene per la
Green Fluorescent Protein (GFP), che possono essere rilevati rispettivamente
mediante tecniche di bioluminescenza e spettrofluorimetriche.
I biosensori quindi stanno emergendo come metodi nuovi e sicuri per rilevare gli
inquinanti ambientali come l’arsenico. Essi non sono destinati a sostituire
completamente i metodi chimici ma possono offrire un monitoraggio rapido ed in loco
anche di tracce del composto target, in paragone a metodologie cromatografiche
analitiche non portatili. I biosensori permettono misure quantitative o semi-
quantitative del target, grazie a elementi di riconoscimento biologici (cellule, anticorpi,
DNA, RNA, enzimi o recettori proteici) accoppiati a trasduttori fisici. Ad oggi, i
biosensori batterici sono per la maggior parte basati sull’utilizzo di microrganismi
mesofili, quelli termofili però sono buoni candidati per la costruzione di biosensori
cellulari ed enzimatici più stabili e forti. I vantaggi dell’utilizzo di organismi termofili
sono collegati alla loro elevata resistenza alla temperatura e agli agenti caotropici o
ai detergenti spesso presenti nei rifiuti industriali e nelle acque di scarico. Questi
microrganismi rappresentano quindi una risorsa considerevole nello sviluppo di nuovi
processi biotecnologici.
Per realizzare un biosensore è preliminare l’identificazione di elementi responsivi alla
sostanza che si vuole rilevare, quindi il principale obiettivo di questa tesi è stato
caratterizzare a livello molecolare il meccanismo di resistenza all’arsenico di
Thermus thermophilus e la realizzazione di biosensori cellulari ed enzimatici per
rilevare l’inquinamento da arsenico nei terreni e nelle acque; un altro obiettivo è stato
l’identificazione di nuovi microrganismi arsenico-tolleranti e la caratterizzazione del
loro meccanismo di resistenza.
Il batterio termofilo gram negativo T. themophilus HB27 è in grado di crescere in
presenza di arsenato e arsenito in un intervallo di concentrazioni letali per altri
organismi; i putativi geni di resistenza non sono stati trovati in un singolo operone di
resistenza ma associati a geni cromosomali apparentemente non collegati
funzionalmente, questi sono: un arsenato reduttasi, un regolatore trascrizionale ed
una proteina di membrana di trasporto; l’arsenato reduttasi TtArsC è stata
precedentemente caratterizzata.
Per la realizzazione del biosensore, è stato ricercato nel genoma di T. themophilus il
regolatore trascrizionale che può fungere da metallo-sensore; il regolatore
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