Design und Synthese neuartiger Inhibitoren für den ABC-Transporter Breast Cancer Resistance ...

335 Pages·2011·4.73 MB·German

by  Kerstin Steggemann

Design und Synthese
neuartiger Inhibitoren für den ABC-Transporter
Breast Cancer Resistance Protein
Dissertation
zur
Erlangung des Doktorgrades (Dr. rer. nat.)
der
Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät
der
Rheinischen Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn
vorgelegt von
Kerstin Steggemann
aus
Stadtlohn
Bonn, Februar 2011

Angefertigt mit Genehmigung der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät der
Rheinischen Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn
Im Rahmen des Graduiertenkollegs 677
„Struktur und molekulare Interaktion als Basis der Arzneimittelwirkung“
1. Gutachter: Prof. Dr. M. Wiese
2. Gutachter: Prof. Dr. G. Bendas
Tag der Promotion: 23. Mai 2011
Diese Schrift ist auf dem Hochschulschriftenserver der ULB Bonn
http://hss.uni-bonn.de/diss_online elektronisch publiziert.
Erscheinungsjahr: 2011

Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung...........................................................................................................................1
1.1 ATP-binding cassette Transporter................................................................................................1
1.2 P-Glykoprotein (P-gp)....................................................................................................................4
1.2.1 Struktur und Funktion von P-gp..........................................................................................4
1.2.2 P-gp-Inhibitoren......................................................................................................................7
1.3 Breast Cancer Resistance Protein (BCRP)....................................................................................9
1.3.1 Struktur und Funktion von BCRP........................................................................................9
1.3.2 BCRP-Inhibitoren..................................................................................................................12
1.4 Bestimmung der Hemmwirkung mittels zellbasierter Assays..............................................14
1.4.1 Hoechst 33342-Assay............................................................................................................15
1.4.2 Calcein AM-Assay................................................................................................................16
2 Ziel der Arbeit.................................................................................................................18
3 Projekt A: Synthese neuartiger Tryprostatin-Analoga............................................22
3.1 Publizierte Tryprostatin- und Fumitremorgin C-Analoga.....................................................22
3.2 Syntheseweg für die Tryprostatin-Analoga..............................................................................24
3.3 Syntheseweg für die Fumitremorgin C-Analoga.....................................................................29
3.4 Ergebnisse der pharmakologischen Testung ...........................................................................31
4 Projekt B: Synthese neuartiger Tariquidar-Analoga...............................................33
4.1 Publizierte Tariquidar-Analoga..................................................................................................33
4.2 Tariquidar-Analoga mit modifizierter Anthranilsäure-Partialstruktur...............................39
4.2.1 Syntheseweg zur Modifikation der Anthranilsäure-Partialstruktur............................40
4.3 Tariquidar-Analoga mit zwei Verknüpfungen.........................................................................44
4.3.1 Syntheseweg zur Variation der Verknüpfung..................................................................45
4.4 Verkleinerte Tariquidar-Analoga mit einer Verknüpfung......................................................49
4.4.1 Syntheseweg für die verkleinerten Tariquidar-Analoga................................................51
4.4.1.1 Allgemeines Syntheseschema.....................................................................................51
4.4.1.2 Isocyanatherstellung....................................................................................................52
i
4.5 Ergebnisse der pharmakologischen Testung............................................................................55
4.5.1 Tariquidar-Analoga mit modifizierter Anthranilsäure-Partialstruktur.......................55
4.5.2 Tariquidar-Analoga mit zwei Verknüpfungen................................................................56
4.5.3 Verkleinerte Tariquidar-Analoga mit einer Verknüpfung.............................................58
5 Projekt C: Synthese neuartiger disubstituierter Anthranilsäure-Derivate.........60
5.1 Syntheseplanung für die neue Wirkstoffklasse........................................................................60
5.2 Synthesewege für die disubstituierten Anthranilsäure-Derivate..........................................62
5.2.1 Allgemeines Syntheseschema.............................................................................................62
5.2.2 Verkleinerung der Grundstruktur.....................................................................................64
5.2.3 Variation der 1. aromatischen Struktur.............................................................................65
5.2.4 Variation der 1. Verknüpfung.............................................................................................72
5.2.5 Variation der 2. aromatischen bzw. Anthranilsäure-Partialstruktur............................77
5.2.6 Variation der 2. Verknüpfung.............................................................................................80
5.2.7 Variation der 3. aromatischen Struktur.............................................................................83
5.2.8 Variation des Substitutionsmusters am 2. Aromaten......................................................88
5.2.9 Dimerisierung........................................................................................................................90
5.3 Ergebnisse der pharmakologischen Testung............................................................................93
5.3.1 Verkleinerung der Grundstruktur.....................................................................................93
5.3.2 Variation der 1. aromatischen Struktur.............................................................................95
5.3.3 Variation der 1. Verknüpfung.............................................................................................98
5.3.4 Variation der 2. aromatischen bzw. der Anthranilsäure-Partialstruktur.....................99
5.3.5 Variation der 2. Verknüpfung...........................................................................................100
5.3.6 Variation der 3. aromatischen Struktur...........................................................................102
5.3.7 Variation des Substitutionsmusters am 2. Aromaten....................................................103
5.3.8 Ergebnisse des P-gp- und MRP1-Screenings.................................................................104
5.4 Untersuchung der Struktur-Wirkungs-Beziehungen............................................................105
6 Zusammenfassung und Ausblick.............................................................................114
7 Experimenteller Teil.....................................................................................................120
7.1 Allgemeine Materialien und Methoden..................................................................................120
7.2 Allgemeine Arbeitsvorschriften (AAV)...................................................................................123
ii
7.2.1 AAV für die Tryprostatin- und Fumitremorgin C-Analoga (Projekt A)....................123
7.2.2 AAV für die Tariquidar-Analoga (Projekt B)..................................................................125
7.2.3 AAV für die disubstituierten Anthranilsäure-Derivate (Projekt C)............................127
7.3 Monographien.............................................................................................................................130
7.3.1 Monographien der Tryprostatin- und Fumitremorgin C-Analoga (Projekt A)........130
7.3.1.1 Tryprostatin-Analoga................................................................................................130
7.3.1.2 Fumitremorgin C-Analoga.......................................................................................143
7.3.2 Monographien der Tariquidar-Analoga (Projekt B)......................................................147
7.3.2.1 Tariquidar-Analoga mit modifizierter Anthranilsäure-Partialstruktur............147
7.3.2.2 Tariquidar-Analga mit zwei Verknüpfungen........................................................157
7.3.2.3 Verkleinerte Tariquidar-Analga mit einer Verknüpfung.....................................175
7.3.3 Monographien der disubstitutierten Anthranilsäure-Derivate (Projekt C)..............186
7.3.3.1 Verkleinerung der Grundstruktur...........................................................................186
7.3.3.2 Variation der 1. aromatischen Struktur..................................................................195
7.3.3.3 Variation der 1. Verknüpfung...................................................................................234
7.3.3.4 Variation der Anthranilsäure-Partialstruktur........................................................249
7.3.3.5 Variation der 2. Verknüpfung...................................................................................268
7.3.3.6 Variation der 3. aromatischen Struktur..................................................................274
7.3.3.7 Variation des Substitutionsmusters am 2. Aromaten...........................................289
7.3.3.8 Dimerisierung.............................................................................................................299
7.3.4 Beschreibung der verwendeten in silico-Methoden.....................................................305
8 Abkürzungsverzeichnis..............................................................................................308
9 Literaturverzeichnis.....................................................................................................311
10 Veröffentlichungen....................................................................................................327
11 Verfassungserklärung................................................................................................328
iii

Einleitung | 1
1 Einleitung
1.1 ATP-binding cassette Transporter
ATP-binding cassette (ABC) Transporter kommen ubiquitär in allen Prokaryoten und Eukaryoten
vor und stellen eine der größten Familien der Membranproteine dar [1-3]. Alle ABC-Transporter
haben gemeinsam, dass sie über eine Nukleotidbindungsdomäne (NBD) Adenosintriphosphat
(ATP) binden, und die Energie aus der ATP-Hydrolyse für den Transport unterschiedlicher
Substrate verwenden. Die NBDs besitzen im Genom aller Influx- und Effluxtransporter aus dieser
Superfamilie drei hochkonservierte Motive. Neben dem Walker A- und dem Walker B-Motiv, die
auch in ATPasen vorkommen, weisen ABC-Transporter zusätzlich ein unverkennbares LSGG- bzw.
ABC-Signatur-Motiv auf [4, 5]. Im menschlichen Erbgut konnten 49 ABC-Transportergene
identifiziert werden [6]. Es sind allerdings bislang nur 48 funktionsfähige Proteine bekannt [7]. Ein
Vergleich der Gensequenzen aller humaner ABC-Proteine führte zur Einteilung in sieben
Subfamilien (ABCA bis ABCG).
Die kleinste funktionelle Einheit eines eukaroytischen ABC-Transporters besteht aus zwei NBDs
und zwei transmembranären Domänen (TMDs). In einem Volltransporter befinden sich diese vier
Domänen in einem Protein, wohingegen ein Halbtransporter aus nur einer NBD und einer TMD
aufgebaut ist. Aus diesem Grund müssen sich hier für den Transport mindestens zwei Einheiten als
Homodimer oder Heterodimer zusammenbinden [2, 7]. Die beiden NBDs, die sich in der Zelle auf
der zytosolischen Seite befinden, benötigt das Protein für die Energiegewinnung aus ATP. Aus den
α-Helices der TMDs formt sich eine Pore durch die Membran, wodurch die Substrate geschleust
werden können [7].
2 | Einleitung
Die Substrate der ABC-Transporter zeigen eine hohe strukturelle Diversität. So werden zum
Beispiel Zucker, Aminosäuren, Lipide, Peptide, Ionen, Toxine oder auch Arzneistoffe durch die
zelluläre Lipidmembran befördert [8]. Die am besten untersuchten ABC-Transporter P-
Glykoprotein (P-gp), die Multidrug Resistance-Associated Proteine 1 und 2 (MRP 1 und 2) und das
Breast Cancer Resistance Protein (BCRP) befördern als Exporter eine große Bandbreite an
hydrophoben Verbindungen. Bezüglich ihres strukturellen Aufbaus, ihres Molekulargewichts und
ihrer Ladungsverteilung sind die Substrate sehr vielfältig [9].
Die oben genannten ABC-Transporter P-gp, MRP1, MRP2 und BCRP werden im menschlichen
Körper in Organen exprimiert, die für Absorptions-, Metabolisierungs- und Exkretionsprozesse
von Arzneistoffen eine große Rolle spielen [9, 10]. Darüber hinaus treten sie verstärkt an wichtigen
Blut-Gewebe-Barrieren wie zum Beispiel der Blut-Hirn-Schranke, der Blut-Testis-Schranke oder der
Plazenta auf, und schützen dadurch den Körper vor der Kontamination mit xenobiotischen Stoffen
[10]. Es wurde festgestellt, dass einige ABC-Transporter mit dem Cytochrom P450 (CYP)-System
ein abgestimmtes „Chemoimmunosystem“ bilden [11]. Das wichtigste CYP-Enzym CYP3A4 und P-
gp weisen große Überschneidungen bei der Verteilung im Gewebe auf. Darüber hinaus konnten
Wacher et al. zeigen, dass viele Substrate von CYP3A4 ebenfalls von P-gp transportiert werden [12].
Dieses Zusammenspiel zwischen P-gp und CYP3A4 führt dazu, dass ein Arzneistoff über
Extrusion und Reabsorption länger metabolisch umgesetzt und dadurch vollständig aus dem
Körper eliminiert werden kann [9, 13]. Die breite Substraterkennung der multispezifisch
arbeitenden ABC-Transporter birgt in der Arzneistofftherapie ein hohes Potential an
unerwünschten pharmakokinetischen Interaktionen. Daher werden bereits in der präklinischen
Phase Untersuchungen durchgeführt, die zeigen, ob ein Wirkstoffkandidat als Substrat erkannt
wird oder zur Hemmung eines Transportproteins führt [14, 15].
ABC-Transporter können in unterschiedlichen Organismen Resistenzen verursachen, wie z. B.
Antibiotikaresistenzen von Bakterien, Antimykotikaresistenzen bei Pilzen, Arzneistoffresistenzen
von parasitisch lebenden Protozoen, Herbizidresistenzen von Pflanzen und Tumorresistenzen beim
Menschen [4]. An der humanen klassischen Multidrug Resistenz (MDR) von Tumorzellen sind die
ABC-Transporter P-gp, MRP1, MRP2 und BCRP beteiligt. Durch die Expression der
Transportproteine werden Zytostatika aus der Tumorzelle herausgeschleusst, so dass die
Arzneistoffkonzentrationen im Zellinneren unterhalb des therapeutischen Bereich liegen. Mit der