Table Of ContentDesign and development of novel
chitosan/hyaluronic acid-based
nanocarriers for gene delivery
Nicolas Duceppe
Biomedical Engineering Department
McGill University
Montreal, Canada
May 2011
A thesis submitted to McGill University, Faculty of Graduate and
Postdoctoral
Studies, in partial fulfillment of the requirements of the degree of doctor of
philosophy.
Copyright © Nicolas Duceppe 2011
Abstract
A number of innovative techniques were developed to carry genetic
material into cells, making gene therapy one of the most active fields in
biotechnology. Interest in this domain is due to two factors: the
therapeutic potential of the approach and lack of delivery systems which
fulfil all requirements for clinical implementation. The advent of new
nanotechnologies, combined with a better understanding of biological
processes, enables the development of more sophisticated tools for
delivery of genetic material to cells. This thesis reports on these novel
nanocarriers with promising features for gene delivery.
The first part of this thesis describes the state of the art of gene delivery
approaches relevant to the research conducted throughout this PhD
project. Major gene delivery systems are described to give insight into
current advancements, limitations and challenges in the field. This section
is followed by a review of therapeutic agent delivery using chitosan-
based nanocarriers. In this review, we provide a summary of the most
important progress concerning the use of chitosan to produce
nanocarriers for several forms of delivery; this includes small molecules,
proteins and genetic material. New trends in the area of gene delivery
such as the development of stimuli-sensitive devices are described in a
separate chapter in order to illustrate the new trends in the field of
therapeutic delivery. Together, these three chapters provide a
background to better understand the motivation behind the
development of the nanocarriers.
The second part of the thesis focuses on design and assembly of novel
non-viral nanocarriers for gene delivery applications. The characterization
II
and optimization of a delivery system formulated with chitosan and
hyaluronic acid are presented, providing an original and viable option to
transfer genetic material into cells. The functionalization of the chitosan-
based nanocarriers, to obtain an ultraviolet light stimuli-sensitive gene
delivery system, is also accomplished, allowing a better control of the
spatiotemporal release of genetic material. Validation of the assembly,
combined with a proof of concept of nanocarrier functionality, is
demonstrated.
The research conducted during this PhD thesis represents a significant step
towards the development of a new generation of smart carriers, with safer
and more efficient delivery of therapeutics. It provides the foundation for
further development of a low-cost and easy to produce delivery system,
with readily available, biocompatible and biodegradable materials with
tunable properties.
III
Résumé
Une multitude de techniques innovatrices ont été établies, pour
transporter ou effectuer la correction de gènes à l’intérieur des cellules;
rendant la thérapie génique un des secteurs les plus actifs de la
recherche biomédicale. L’intérêt pour ce champ d'expertise est
principalement attribuable à deux principaux facteurs : les gigantesques
attentes médicales associées à ce type de traitement, ainsi que
l’absence de système présentant les caractéristiques nécessaires pour
l’implémentation de cette technologie, dans le milieu clinique.
L’avènement de procédés novateurs, combiné à une compréhension
plus approfondie des processus biologiques, rend possible l'élaboration
d’outils plus sophistiqués pour la vectorisation de matériel génétique. En
l’occurrence, cette thèse expose une de ces nouvelles innovations, par la
présentation d’un nanotransporteur comportant des particularités
avantageuses, pour de futures applications dans le domaine de la
thérapie génique.
La première partie de cet ouvrage offre une vue d’ensemble des derniers
développements technologique, en relation avec le projet de recherche
de ces études de PhD. Un survol des principaux progrès technologies,
pour exécuter l'insertion d'information génétique à l’intérieur des
organismes, est décrit. Cela permet de connaître les limitations, les
avancées et les défis actuels qui restent à surmonter pour permettre, à ce
type de traitement, d'être utilisé cliniquement. Cette section est suivie de
deux revues concises de la littérature. L’une présente l'utilisation de
nanotransporteurs, constitués de chitosan, pour le largage d’agents
médicinaux. L'autre décrit les principes fondamentaux, reliés aux systèmes
répondants et sensibles aux stimuli spécifiques afin de libérer des
composées thérapeutiques. La compilation de ces données scientifiques
IV
constitue un élément essentiel dans la conception des transporteurs
réalisés au cours de ce doctorat.
La seconde partie consiste en la conceptualisation, la réalisation et la
validation du concept des nanoparticules à base de chitosan et d’acide
hyaluronique comme véhicule de matériel génétique. L’optimisation et la
caractérisation de ces nanovecteurs, ont été effectuées avec succès ;
fournissant ainsi une avenue prometteuse pour le transfert de gènes à
l’intérieur des cellules. Un composé chimique photosensible a été
synthétisé et incorporé aux nanoparticules décrites ci-haut, pour leur
conférer une fonction particulière : le largage d'ADN en réponse à des
stimuli lumineux.
L’ensemble du travail accompli durant cette thèse a permis de
développer un vecteur du matériel génétique, peu coûteux et facile à
produire, avec des matériaux biocompatibles et biodégradables. Elle
constitue une contribution considérable dans l’élaboration de véhicules
non viraux, pour sa mise en application dans le domaine de la thérapie
génique.
V
Remerciements
En tout premier lieu, j’aimerais remercier avec gratitude famille et amis,
qui ont su me soutenir, tout au long de ces innombrables années. Les
études aux cycles supérieures nécessitent sans aucun doute une bonne
dose de courage, d’ingéniosité, d’audace, de persévérance et de
détermination; mais tout cela n’est possible sans le soutien si précieux de
nos proches.
Ensuite, un remerciement particulier est redevable à la Dre Tabrizian qui
m’a accueillie au sein de son groupe de recherche, et qui a rendu
possible l’accomplissement de ce projet de recherche. Par la même
occasion, je tiens à adresser mes reconnaissances aux membres du
comité consultatif de thèse, qui ont encadré et appuyé la réalisation de
ce projet de recherche.
Les études au niveau doctoral font appel à une combinaison de
technologies et d’expertises de fine pointe. Par conséquent, je tiens à
remercier tous ces experts qui ont contribué, par leur disponibilité, leur
aide, leur connaissance ainsi que leur convivialité, à l’atteinte des
objectifs de recherche, présentés dans cette thèse. Ceci inclus Mme
Jeannie Mui, Dr David Liu et Dr Kelly Sears du FEMR, Dre Tara Sprules du
Quebec/Eastern Canada NMR Centre, Dr Ian Buttler et Dre Archana Tiwari
du département de chimie de McGill et le Dr David Junker et son groupe
de recherche. Ceci est sans oublier Mme Line Mongeon, spécialiste des
méthodes de microscopie, qui a toujours fait preuve d’un grand
professionnalisme et d’une bonté remarquable.
VI
Ces années passées à McGill m’ont également donné l’opportunité
d’initier à la recherche, de former et d’encadrer des stagiaires de 1er
cycle universitaire ; soit Xiao (Alice) Fang Zhang et Kenrry Chiu. Ceux-ci
m’ont permis de mettre en pratique mes habilités de gestion, de
supervision et d’enseignement, mais avant tout, de partager ma passion
pour la science. Leur court passage dans ce laboratoire restera pour moi,
un souvenir mémorable. Par la même occasion, je tiens à remercier les
membres du laboratoire pour leur dynamisme et leur support. Tous
particulièrement, je tiens à dire un grand merci à Dre Anna Hillberg, Dr
Hubert Gagnon, Simone Houng et Kristen Bowey pour m’avoir offert, de
bon cœur, une assistance dans les tâches d’édition. Enfin, je tiens à
remercier le personnel administratif, en l’occurrence, Nadia Morrone,
Andrew Pearce, Lina Vuch, Pina Sorrini et Nancy Abate pour leur travail
essentiel et leur cordialité exemplaire.
À tous, Merci.
VII
Table of Contents
Design and development of novel chitosan/hyaluronic acid-based nanocarriers
for gene delivery .......................................................................................................................... I
Abstract ........................................................................................................................... II
Résumé ........................................................................................................................... IV
Remerciements ............................................................................................................. VI
Table of Contents ........................................................................................................ VIII
List of Figures and Tables ............................................................................................ XIV
Acronyms ..................................................................................................................... XVI
Contribution of Authors ............................................................................................ XVIII
Chapter 1 – Introduction .......................................................................................................... 1
1.1 State of the Art .......................................................................................................... 1
1.2 Thesis outline ............................................................................................................. 3
Chapter 2 - Rationale, hypothesis and objectives ............................................................ 5
2.1 Rationale ................................................................................................................... 5
2.2 Hypothesis ................................................................................................................. 7
2.3 Objectives ................................................................................................................. 7
2.3.1 Investigations of physicochemical parameters affecting chitosan /
hyaluronic acid self-assembly to design and assemble a novel non-viral
nanocarrier for gene delivery ......................................................................................... 7
2.3.2 Integration of photo-labile moieties to the chitosan-based nanocarriers
and validation of their light-sensitive properties ........................................................ 8
2.3.3 Assessment of the potential of the nanocarriers for in vitro gene transfer 8
3.1 Gene Therapy......................................................................................................... 10
3.2 Transfection process .............................................................................................. 12
3.3 Main categories for transfection .......................................................................... 17
VIII
3.3.1 Physical methods for gene delivery .................................................................. 18
3.3.1.1 Electroporation ................................................................................................. 19
3.3.1.2 Sonoporation .................................................................................................... 21
3.3.1.3 Biolistic ................................................................................................................. 22
3.3.1.4 Hydrodynamic transfection .......................................................................... 23
3.3.1.5 Microinjection ................................................................................................... 24
3.3.1.6 Magnetofection ............................................................................................... 25
3.3.1.7 Laser-mediated gene delivery .................................................................... 25
3.3.1.8 Summary ............................................................................................................ 26
3.3.2 Carrier-mediated gene delivery ........................................................................ 27
3.3.2.1 Viral ...................................................................................................................... 28
3.3.2.1.1 Retrovirus ..................................................................................................... 29
3.3.2.1.2 Adenovirus ................................................................................................. 29
3.3.2.1.3 Adeno-associated virus .......................................................................... 30
3.3.2.1.4 Herpes virus ................................................................................................ 31
3.3.2.1.5 Togavirus ..................................................................................................... 31
3.3.2.1.6 Poxvirus ........................................................................................................ 31
3.3.2.1.7 Other ............................................................................................................ 32
3.3.2.1.8 Summary ..................................................................................................... 33
3.3.2.2 Non-viral ............................................................................................................. 34
3.3.2.2.1 Lipid .............................................................................................................. 35
3.3.2.2.2 Protein & Peptide ..................................................................................... 36
3.3.2.2.2.1 Cell-penetrating peptide ............................................................... 36
3.3.2.2.2.2 Histofection ......................................................................................... 36
3.3.2.2.3 Synthetic polymer .................................................................................... 37
3.3.2.2.4 Unclassified carrier ................................................................................... 38
3.3.2.2.5 Polysaccharide ......................................................................................... 39
3.4 Literature review ..................................................................................................... 41
3.4.1 Abstract ................................................................................................................ 43
3.4.1.1 Importance of the field ...................................................................................... 43
IX
3.4.1.2 Areas covered in this review ............................................................................ 43
3.4.1.3 What the reader will gain .................................................................................. 43
3.4.1.4 Take home message .......................................................................................... 44
3.4.1.5 Keywords ................................................................................................................ 44
3.4.2 Introduction ......................................................................................................... 45
3.4.2.1 Primary properties of chitosan: toxicity, biodegradability and solubility
................................................................................................................................................ 46
3.4.2.2 Size Dependent Biodistribution ........................................................................ 48
3.4.3 Functionalized Chitosan-Based Nanoparticles Delivery System ................. 51
3.4.3.1 Chitosan Functionalization for Enhanced Targeting Abilities.................. 51
3.4.3.2 Chitosan Functionalization for Enhanced Tracking Abilities .................... 55
3.4.4 Chitosan Polyplexes ........................................................................................... 57
3.4.4.1 Chitosan-Based Grafted Polymers ................................................................. 57
3.4.4.2 Chitosan-Based Polyelectrolyte Complexes ............................................... 58
3.4.5 Chitosan Nanoparticles as Drug Delivery Vehicle ......................................... 59
3.4.5.1 Chitosan Nanoparticles as a Delivery Vehicle for Insulin ......................... 60
3.4.5.2 Chitosan Nanoparticles as a Delivery Vehicle for Anti-Tumor Drugs .... 60
3.4.5.3 Chitosan Nanoparticles as a Delivery Vehicle for Ocular Drugs ........... 63
3.4.5.4 Chitosan Nanoparticles as a Vehicle for the Delivery of Drugs through
Olfactory Neurons ............................................................................................................. 63
3.4.5.5 Chitosan Nanoparticles as a Vehicle for Delivery of Antibiotics ............ 64
3.4.5.6 Chitosan Nanoparticles for Gene Delivery .................................................. 64
3.4.6 Chitosan for Gene Delivery In vitro .................................................................. 65
3.4.6.1 Effect of Chitosan Structural Properties ......................................................... 65
3.4.6.2 Effect of Plasmid Length, Nanocarrier Size and Zeta potential ............. 68
3.4.6.3 Effect of Experimental Parameters ................................................................. 69
3.4.7 General Discussion ............................................................................................. 74
3.4.8 Expert Opinion ..................................................................................................... 76
Acknowledgments ...................................................................................................... 77
X
Description:chitosan/hyaluronic acid-based nanocarriers for gene delivery. Nicolas Duceppe. Biomedical Engineering Department. McGill University. Montreal, Canada. May 2011. A thesis submitted to McGill University, Faculty of Graduate and. Postdoctoral. Studies, in partial fulfillment of the requirements of th
