Desarrollo y aplicación de herramientas genómicas - RiuNet - UPV

382 Pages·2012·6.9 MB·Spanish

Desarrollo y aplicación de herramientas genómicas para la
mejora de especies cucurbitáceas por calidad y resistencia a
enfermedades.

TESIS DOCTORAL
Presentada por:
Cristina Esteras Gómez

Dirigida por:
Dra. María Belén Picó Sirvent

Valencia, mayo 2012

Agradecimientos
Quiero expresar mi agradecimiento de forma muy especial a la directora de esta Tesis,
la Dra. Belén Picó, por su constante apoyo durante todos estos años, por tantas
enseñanzas recibidas y por la total confianza que ha depositado siempre en mí. Así
mismo, me gustaría agradecer al Dr. Fernando Nuez, director del COMAV, el haberme
dado la posibilidad de realizar los trabajos de la presente Tesis doctoral en el marco de
varios proyectos desarrollados en dicho Instituto.
Desearía dar las gracias también a todos aquellos que han colaborado de una forma u
otra a que saliera adelante este trabajo, en especial a Cristina Roig, que tantas cosas me
ha enseñado y con la que tantas horas he pasado en el laboratorio, a José Blanca,
Antonio Monforte, Joaquín Cañizares, Pello Ziarsolo y los investigadores de otras
instituciones con las que se ha colaborado como el IRTA, IFAPA y la Universidad de
Nápoles Federico II.
También agradecer todo su apoyo a todos mis compañeros del COMAV, con los que he
compartido tantas horas, y en especial a los que “conviven” conmigo en el despacho, a
Alicia, Javi y Santi, por sus inestimables consejos siempre que las cosas no salían, su
ayuda y sus risas en tantos otros momentos. Y, por supuesto, a todos aquellos que en
algún momento u otro han pertenecido al grupo de Cucurbitáceas del COMAV, en
especial a Eva y Mercè.
Finalmente, mi más profundo agradecimiento a mi familia, sin la cual nada de esto
habría sido posible, y en especial a Juanra, por toda su paciencia en los malos
momentos.

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ABSTRACT
Melon (Cucumis melo) and summer squash (Cucurbita pepo) are economically
important cucurbits cultivated worldwide. New, better-adapted, cultivars, resistant to
pests and diseases, and varieties displaying better quality traits are required to optimize
their production and to meet market demands. Crop breeding must be carried out
efficiently and competitively, using the existing genetic knowledge and the molecular
tools available for each species. The development of genomic tools to speed up
Cucurbits breeding programs is the main objective of this Doctoral Thesis.
Molecular markers are essential tools for the construction of genetic maps, for an
efficient MAS selection, for QTL (Quantitative Trait Loci) analysis and mapping and
for the development of new breeding populations. Molecular markers are also necessary
tools for biodiversity analysis. High-quality markers, such as microsatellites (Simple
Sequence Repeats, SSRs) and SNPs (Single Nucleotide Polymorphisms) have been
developed and/or validated for both species in this Thesis. The generation of sequence
information, required for the development of SSRs and SNPs has dramatically changed
in the last 6 years due to the advent of new technological advances. In fact, a fairly
complete melon transcriptome has been produced using high-throughput 454
sequencing (NGS, Next Generation Sequencing) and combining the newly produced
ESTs with the previously existing Sanger sequences. The melon transcriptome
characterization presented is the most complete to date (53.252 unigenes with over 63%
of them annotated). The generation of large SSRs and SNPs collections for these
species, by mapping the ESTs (Expressed Sequence Tags) against the new version of
the transcriptome has been a great achievement starting a new era in melon breeding.
The obtained collection of molecular markers (more than 3.000 SSRs and 38.000 SNPs)
has allowed the construction of melon maps with increased marker density.
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Similar resources have been developed for the first time in C. pepo. SSRs identified in
the C. pepo transcriptome sequencing project has been applied to localize landraces
with favourable commercial traits and whose alleles might be exploited in breeding
programs. Likewise, the usefulness of both EST-SSRs and genomic SSRs for depicting
genetic relationships has been proved. On the other hand, the employment of the first
SNP set identified for Cucurbita through a massive genotyping platform, GoldenGate,
has been a success (90%). The genetic map obtained, with more than 300 SNPs, has
allowed to map a large set of QTLs related to early flowering, femaleness tendency,
shape, size and fruit color, and other traits of interest in breeding.
Therefore, these works report the validation and application of previously developed
markers and the generation of new genomic tools to speed up the breeding process of
these crops. The paper-based format of this Thesis confirms the interest of the obtained
results.

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RESUMEN
El melón (Cucumis melo) y el calabacín (Cucurbita pepo) son especies cucurbitáceas de
gran importancia económica a nivel nacional y mundial. Para optimizar su producción
se requiere de la obtención de nuevas variedades mejor adaptadas a los sistemas de
cultivo, más resistentes frente a nuevas enfermedades o plagas y con mejores
características organolépticas, que respondan a las cada vez mayores exigencias del
mercado. La mejora debe realizarse de una forma eficiente y competitiva, apoyándose
en los crecientes conocimientos genéticos en estas dos especies y en los últimos avances
biotecnológicos. El desarrollo de herramientas genómicas con el fin de impulsar la
mejora de estos cultivos es el principal objetivo de la presente Tesis doctoral.
El desarrollo de marcadores moleculares es esencial para la construcción de mapas
genéticos, para la realización de una selección más eficiente, para el análisis y
cartografía de QTLs (Quantitative Trait Loci) y para el desarrollo de líneas de
premejora, además de ser una herramienta fundamental para el análisis de la
biodiversidad. En esta Tesis se han desarrollo y/o validado marcadores de alta calidad,
de tipo microsatélite (Simple Sequence Repeats, SSRs) y SNPs (Single Nucleotide
Polymorphisms), para estas dos especies. La generación de información de secuencia,
necesaria para el desarrollo de este tipo de marcadores, ha cambiado en el transcurso de
los trabajos presentados en la Tesis, habiéndose abordado finalmente la secuenciación
del transcriptoma de melón mediante técnicas de secuenciación de alto rendimiento
(NGS, Next Generation Sequencing). La obtención de grandes colecciones de SSRs y
SNPs en ambas especies, resultado del ensamblaje de ESTs (Expressed Sequence Tags)
procedentes de secuencias Sanger previamente disponibles y de las nuevas secuencias
obtenidas por secuenciación masiva, ha supuesto un gran avance para estas especies no
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modelo, permitiendo la construcción de mapas más densos en melón y del primer mapa
basado en SNPs en calabacín.
En melón, la caracterización del transcriptoma presentada es, con 53.252 unigenes, de
los cuales el 63% están anotados funcionalmente con términos GO, la más completa que
existe. Este transcriptoma ha proporcionado una valiosa información para la anotación
del genoma, actualmente en fase de publicación. Además de la identificación de más de
3.000 SSRs y 38.000 SNPs, ha supuesto el desarrollo de herramientas bioinformáticas
para la selección de marcadores polimórficos entre diversos morfotipos de interés, lo
que abre camino a una nueva era en la mejora de este cultivo.
La aplicación de los SSRs identificados gracias a la secuenciación del transcriptoma de
C. pepo ha servido para localizar cultivares tradicionales cuya riqueza alélica podría ser
explotada con fines comerciales. Asimismo, ha confirmado la eficacia de los EST-SSRs
frente a los de origen genómico para estudios de variabilidad. Por otra parte, la
utilización de los primeros SNPs identificados para Cucurbita ha supuesto la primera
aplicación, con un 90% de éxito, de una plataforma de genotipado masivo, GoldenGate,
en este género. El mapa genético basado en más de 300 SNPs ha permitido cartografiar
un amplio conjunto de QTLs relacionados con la precocidad de la floración, la
tendencia femenina de la planta, la forma, tamaño y coloración del fruto, además de
otros caracteres que resultan de gran interés para la mejora.
Por tanto, estos trabajos suponen la validación y la aplicación de marcadores
previamente desarrollados y la generación de nuevas herramientas genómicas que
supondrán la aceleración del proceso de mejora de estos cultivos. El formato de la Tesis
basado en artículos ya publicados por el grupo confirma el interés de los resultados
obtenidos.

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RESUM
El meló (Cucumis melo) i la carabasseta (Cucurbita pepo) són espècies cucurbitàcies de
gran importància econòmica a nivell nacional i mundial. Per a optimitzar la seua
producció es requereix de l´obtenció de noves varietats millor adaptades als sistemes de
conreu, més resistents a noves malalties o plagues i amb millors característiques
organolèptiques, que responguen a les cada vegada majors exigències del mercat. La
millora ha de realitzar-se d´una forma eficient i competitiva, basant-se en els creixents
coneiximents genètics en aquestes dues espècies i en els últims avançaments
biotecnològics. El desenvolupament de ferramentes genòmiques per a impulsar la
millora d´aquests conreus és el principal objectiu de la present Tesi doctoral.
El desenvolupament de marcadors moleculars és essencial per a la construcció de mapes
genètics, per a la realització d´una selecció més eficient, per a l´anàlisi i cartografia de
QTLs (Quantitative Trait Loci) i per al desenvolupament de línies de premillora, a més
de ser una ferramenta fonamental per a l´anàlisi de la biodiversitat. En aquesta Tesi
s´han desenvolupat i/o validat marcadors d´alta qualitat, tipus microsatèl.lit (Simple
Sequence Repeats, SSRs) i SNPs (Single Nucleotide Polymorphisms), per ambdues
espècies. La generació d´informació de seqüència, necessària per al desenvolupament
d´aquest tipus de marcadors, ha canviat en el transcurs dels treballs presentats en la
Tesi, havent-se abordat finalment la seqüenciació del transcriptoma de meló mitjançant
tècniques de seqüenciació d´alt rendiment (NGS, Next Generation Sequencing).
L´obtenció de grans col.leccions de SSRs i SNPs en les dues espècies, resultat de
l´acoblament d´ESTs (Expressed Sequence Tags) procedents de seqüències Sanger
prèviament disponibles i de les noves seqüències obtingudes per seqüenciació massiva,
ha suposat un gran avançament per a aquestes espècies no model, permitint la
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construcció de mapes més densos en meló i del primer mapa basat en SNPs en
carabasseta.
En meló, la caracterització del transcriptoma presentada és, amb 53.252 unigens, dels
quals el 63% estan anotats funcionalment amb termes GO, la més completa que
existeix. Això ha proporcionat una valuosa informació per a l´anotació del genoma,
actualment en fase de publicació. A més, la identificació de més de 3.000 SSRs i 38.000
SNPs, ha suposat el desenvolupament de ferramentes bioinformàtiques per a la
sel.lecció de marcadors polimòrfics entre diversos morfotipus d´interés, amb la qual
cosa s´obri camí a una nova era en la millora d´aquest conreu.
L´aplicació dels SSRs identificats gràcies a la seqüenciació del transcriptoma de C.
pepo ha servit per a localitzar cultivars tradicionals, la riquesa al.lèlica dels quals podria
ser explotada amb objectius comercials. A més, ha confirmat l´eficàcia dels EST-SSRs
respecte als d´origen genòmic per a estudis de variabilitat. Per una altra banda, la
utilització dels primers SNPs identificats per a Cucurbita ha suposat la primera
aplicació, amb un 90% d´èxit, d´una plataforma de genotipat massiu, GoldenGate, en
aquest gènere. El mapa genètic basat en més de 300 SNPs ha permés cartografiar un
ampli conjunt de QTLs relacionats amb la precocitat de la floració, la tendència
femenina de la planta, la forma, tamany i coloració del fruit, a més d´altres caràcters que
resulten de gran interés per a la millora.
Aleshores, aquests treballs suposen la validació i l´aplicació de marcadors prèviament
desenvolupats i la generació de noves ferramentes genòmiques que suposaran
l´acceleració del procés de millora d´aquests conreus. El format de la Tesi basat en
articles ja publicats pel grup confirma l´interés dels resultats obtinguts.

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