departamento de anatomía y embriología humana programa de biomedicina tesis doctoral ...

139 Pages·2013·2.57 MB·Spanish

by  Ruth Rubio Amador

DEPARTAMENTO DE ANATOMÍA Y EMBRIOLOGÍA HUMANA
PROGRAMA DE BIOMEDICINA

TESIS DOCTORAL
MODELOS DE SARCOMAGÉNESIS BASADOS EN CÉLULAS MADRE
MESENQUIMALES: INFLUENCIA DE RB Y P53.

Memoria presentada por Ruth Rubio Amador para optar al grado de DOCTOR.
GRANADA, 2013
Editor: Editorial de la Universidad de Granada
Autor: Ruth María Rubio Amador
D.L.: GR 109-2014
ISBN: 978-84-9028-695-1
El doctorando Ruth Rubio Amador y los directores de la tesis Pablo Menéndez Bujan y René
Rodriguez Gonzalez Garantizamos, al firmar esta tesis doctoral, que el trabajo ha sido
realizado por el doctorando bajo la dirección de los directores de la tesis y hasta donde
nuestro conocimiento alcanza, en la realización del trabajo, se han respetado los derechos
de otros autores a ser citados, cuando se han utilizado sus resultados o publicaciones.

Granada, 22 Abril de 2013

Director/es de la Tesis Doctorando

Fdo.: Fdo.:

René Rodriguez Gonzalez Pablo Menéndez Buján Ruth Rubio Amador
AGRADECIMIENTOS
Agradecimientos
Llegado este punto, es inevitable volver la vista atrás y hacer balance de lo que ha ocurrido
en tu vida en los últimos años… Parece mentira que después de tanto tiempo trabajando
en el mundo de la ciencia mi tesis doctoral se haya materializado finalmente. Desde que
acabé mis estudios de biología y decidí dedicarme a esta vida, muchas han sido las
dificultades que me he ido encontrando en el camino, que hicieron que el objetivo que tan
claro tenía de “hacer una tesis” se convirtiera en prácticamente una “misión imposible”.
Durante este periodo de 12 años he vencido la barrera del idioma, he aguantado cambios
inesperados en la vida de los que te rodean que afectan profundamente a tu trayectoria
laboral, he trabajado hasta el límite de mis fuerzas, he superado con éxito un linfoma y
parece que finalmente he acabado la tesis. Por ello, me gustaría mostrar mi más sincero
agradecimiento a todas y cada una de las personas que han pasado por mi vida (aunque
sea por un periodo corto), me han ayudado a superar esas dificultades, y sobre todo me
han animado a no abandonar nunca. Sin todos ellos, nunca hubiera llegado a ser la
persona que soy hoy.
En primer lugar quiero agradecer a mis directores de tesis Pablo Menéndez y René
Rodriguez la oportunidad que me dieron de realizar la tesis en este laboratorio. Por
enseñarme a investigar, por ayudarme a vencer mis miedos y comportarse realmente
como amigos fuera del laboratorio cuando los he necesitado. De ellos no solo he
aprendido una profesión, sino también valores académicos tan importantes como la
capacidad de análisis, la autocritica, la perseverancia y la humildad.
También me gustaría agradecer de forma muy especial la inestimable ayuda de Javi, mi
jefe, mi psicólogo y mi amigo. Me devolvió el “gusanillo” por la ciencia, además de
enseñarme mucho de mesenquimales; he tenido la suerte de haber compartido un tiempo
estupendo contigo.
A la gran familia de Genyo, simplemente por eso, ¡por ser de verdad como mi familia!, por
preocuparse en todo momento y tener palabras de aliento cuando eran necesarias. La
tediosa vida en el laboratorio es mucho más llevadera rodeada de tan buena gente.
A todo mi grupo, no si se puede tener gente con más calidad humana: las Veros, mi guía
espiritual y científica, Clara y Pedro, mis confidentes, mis niños Oscar y Damià, mi alegría
del día a día, mi Rosi querida, mi compañera en la batalla, Mar, por su toque de humor
diario y a Cristina, que tanto me ha ayudado en la última parte de la tesis, la más difícil, y
que viene a tomar el relevo asturiano de René. Aquí además quiero incluir todos los
miembros del antiguo Banco Andaluz de células madre, muy especialmente al grupo
completo de Cholo, porque es mi grupo de adopción, son mis compañeros y mis amigos;
particularmente a mi Angelina, porque “desde que estas en mi vida soy más feliz” by IKEA.
Y por supuesto al grupo de Paco, ya que igualmente me han hecho sentir siempre una de
ellos.
A todos mis amigos, realmente es difícil nombrarlos a todos porque tengo la suerte de
tener tantos de tan buena calidad… Vladana y Marcella, Elena, Milan y Aitor, Criti y Carlos,
Charli, Eli, Marie Laure y Fabian, al Cuass, a ese maravilloso Polo Maldito que tantas
aventuras me ha dado, Javi, Cris y Rubén, y que espero que sea indestructible y le queden
muchos simposiums….. y a tantos más..
A mis abuelos, que ha sido las personas que más me ha apoyado en todas mis decisiones y
aventuras; de ellos tengo el carácter, el coraje y el empuje hacia adelante.
A mis padres por ser el pilar fundamental de todo lo que soy, de toda mi educación, tanto
académica, como de la vida, por su incondicional apoyo a lo largo de toda mi vida y por su
capacidad de adaptación a todos mis planes, por muy disparatados que fueran. Y por
supuesto a mi hermaniti, porque sea como fuere y aunque estemos lejos, ella siempre ha
estado en los momentos más difíciles dándome más alegrías que nadie.
A Barney, mi compañero en la vida, por su paciencia, su apoyo, por todo…
ÍNDICE
Índice

ABREVIATURAS

HIPÓTESIS Y OBJETIVOS

INTRODUCCIÓN

Las Células Madre mesenquimales

I. Características de las células madre

II. Definición y descripción de Células Madre Mesenquimales
II.1 Definición
II.2 Revisión del término

III. Ontogenia de las MSCs

IV. Propiedades de las MSCs
IV.1 Capacidad de diferenciación a distintos linajes celulares
IV.1.1 Diferenciacion osterogénica
IV.1.2 Diferenciación adipogénica
IV.1.3 Diferenciación condrogénica
IV.2 Carencia de inmunogenicidad
IV.3 Propiedades inmunomodulatorias
IV.4 Potencial de expansión in vitro
IV.5 Habilidad para migrar hacia sitios de daño tisular y tumores.

V. Aplicaciones clínicas
V.1 Tratamiento de la enfermedad injerto-contra-huésped (GVHD).
V.2 Rechazo de órganos.
V.3 Reparación tisular.
V.3.1 Reparación ósea
V.3.2 Reparación de cartílago
V.3.3 Reparación de tendón
V.3.4 Reparación muscular
V.3.5 Reparación de heridas crónicas
V.4 Tratamiento de enfermedades autoinmunes.
V.5 Liberación de drogas en terapias anti-cancer.
Cáncer

I. Introducción
I.1 Definición Inmortalización, transformación y metástasis

II.Modelos del cáncer
II.1 Modelo de Mutación o modelo de evolución clonal
II.2 Modelo de la célula de origen o modelo de célula madre tumoral
II.3 Célula madre tumoral (CSC)
II.3.1 Características
Modelo jerárquico
Modelo estocástico
II.3.2 Caracterización
II.3.2.1 Marcadores de CSCs
II.3.2.2 Ensayos con CSCs
II.3.3.3 Diferencias ente CSC y CIC

III. Oncogenes y antioncogenes
III.1 Proto-oncogen y Oncogen: mutación dominante
III.2 Genes supresores de tumores: mutación recesiva
III.3 p53
III.3.1 Características del gen
III.3.2 Función de p53
III.3.3 Mecanismo de regulación
III.3.4 Papel de p53 en cáncer
III.4 Rb
III.4.1 Características del gen
III.4.2 Función de Rb
III.4.3 Rb en cáncer
III.4.3.1 Iniciación del tumor
III.4.3.2 Progresión del tumor
III.5 p53 y Rb en sarcomas
III.5.1 Mutación de p53 en sarcomas
III.5.2 Mutación de Rb en sarcomas

IV. Sarcomas
IV.1 Tumores de tejidos blandos (STS)
IV.1.1 Tipos de tumor y localización
IV.1.2 Etiología
IV.1.3 Alteraciones genéticas más frecuentes en STS.
IV.2 Tumores de hueso primario
IV.2.1 Tipos de tumor y localización
IV.2.2 Etiología
IV.2.3 Alteraciones genéticas más frecuentes en tumores de hueso primario.
IV.3 Clasificación de los sarcomas atendiendo a sus características genéticas
IV.3.1 Leiomyosarcoma
IV.3.1.1Incidencia
IV.3.1.2 Aspectos clínicos
IV.3.1.2.1 Diagnóstico
IV.3.1.2.2 Histopatología
IV.3.1.3 Alteraciones genéticas más frecuentes
IV.3.1.3.1 Alteraciones citogenéticas
IV.3.1.3.2 Alteraciones moleculares
IV.3.2 Osteosarcoma
IV.3.2.1 Incidencia
IV.3.2.2 Aspectos clínicos
IV.3.2.2.1 Diagnóstico
IV.3.2.2.2 Histopatología
IV.3.2.2.3 Cirugía
IV.3.2.3 Alteraciones genéticas más frecuentes
IV.4 Tratamiento

MATERIAL Y METODOS

I. Establecimiento de los cultivos primarios
I.1 Cepas murinas
I.2 Extracción de las células madre mesenquimales del ratón.
I.2.1 Extracción de células madre mesenquimales de médula ósea (BM-MSCs)
I.2.2 Extracción de células madre mesenquimales de tejido adiposo (ASCs)
I.3 Escisión de las regiones flanqueadas por secuencias lox-P mediante la enzima
Cre-recombinasa
I.3.1 Producción de Adenovirus
I.3.2 Infección de los cultivos con Adenovirus AdCre
I.4 Cultivo y mantenimiento de las células.

II. Caracterización de los cultivos MSCs
II.1 Morfología
II.2 Análisis de ADN
II.2.1 Extracción de ADN genómico