DE LA FISH AUX PUCES A ADN

44 Pages·2010·4.58 MB·French

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TECHNIQUES
DE
CYTOGENETIQUE MOLECULAIRE :
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DE LA FISH
masque
AUX PUCES A ADN
KARINE CORDIER-COUREL
XXème colloque ATC
Aix-en-Provence - 2010
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LA CYTOGENETIQUE MOLECULAIRE
Cytogénétique
conventionnelle
Cytogénétique
moléculaire
Biologie moléculaire
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DE LA FISH AUX PUCES A ADN
v FISH (Hybridation In Situ en Fluorescence)
• Principe
• Différents types de sondes
• Applications
• Avantages et inconvénients
v CGH (Hybridation Génomique Comparative)
• Principe
• Sensibilité
v FISH et CGH : Limites des techniques
v Puces à ADN
• Définitions
• Différents types de puces
• CGH-array
• Puces à SNP
• Intérêts, applications, inconvénients
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FISH : Principe
FISH = Fluorescence In Situ Hybridization
v Hybridation de séquences spécifiques marquées sur un
génome entier : centromères, régions sub-télomériques, loci
spécifiques et peintures
Détection de délétions, identification de translocations ou
v
d’autres réarrangements chromosomiques
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FISH : Principe
SONDE CIBLE
ADN double ADN double
brin marqué brin (mitoses
ou noyaux
interphasiques)
Dénaturation
thermique
T A A G G A T A
A T T C C T A T
Hybridation
complémentaire
37°C O/N
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FISH : Principe
Elimination des
sondes non
Lavages
spécifiquement fixées
La sonde moléculaire Pas de sonde fixée
se fixe sur sa cible = délétion
Analyse au microscope en
épifluorescence (filtres adaptés
aux différents fluorochromes)
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FISH : Différents types de sondes
Peintures chromosomiques
Sondes centromériques
M-FISH
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FISH : Différents types de sondes
Loci spécifiques (Tuple1 / N85A3)
Sondes télomériques
RP11-335E8 2p12
Sondes de BACs RP11-356H17 2p13.3
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FISH : Sondes de BAC
v Bacterial Artificial Chromosome = ADN circulaire bactérien
dans lequel un fragment d’ADN (du génome humain) a été
inséré
v Sonde de BAC = sonde fabriquée à partir d’une
séquence d’ ADN connue insérée dans un vecteur de
clonage
bactérien
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FISH : Choix des BACs
v Sélection des BACs selon leur localisation chromosomique (en
fonction du réarrangement à étudier) ou la séquence d’un
gène
d’intérêt
v Séquençage du génome humain
=> Cartographie des chromosomes
=> bases de données