ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ YÜKSEK LİSANS TEZİ Ali COŞKUN ...

132 Pages·2010·1.04 MB·Turkish

ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ
FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ

YÜKSEK LİSANS TEZİ

Ali COŞKUN

ENDÜSTRİYEL ENZİMLER ÜRETEN YENİ BACILLUS SP. SUŞLARININ
İZOLASYONU VE KARAKTERİZASYONU

BİYOTEKNOLOJİ ANABİLİM DALI

ADANA, 2010
ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ
FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ

ENDÜSTRİYEL ENZİMLER ÜRETEN YENİ BACILLUS SP. SUŞLARININ
İZOLASYONU VE KARAKTERİZASYONU

Ali COŞKUN

YÜKSEK LİSANS TEZİ
BİYOTEKNOLOJİ ANABİLİM DALI

Bu tez ………… Tarihinde Aşağıdaki Jüri Üyeleri Tarafından Oybirliği İle
Kabul Edilmiştir.

İmza………………… İmza…………………. İmza…………….…………..
Prof.Dr. Numan ÖZCAN Prof.Dr. Burhan ARIKAN Yrd.Doç.Dr. B. Devrim ÖZCAN
Danışman Üye Üye

Bu Tez Enstitümüz Biyoteknoloji Anabilim Dalında hazırlanmıştır.

Kod No: Prof.Dr. İlhami YEĞİNGİL
Enstitü Müdürü

Not: Bu tezde kullanılan özgün ve başka kaynaktan yapılan bildirişlerin, çizelge, şekil ve fotoğrafların
kaynak gösterilmeden kullanımı, 5846 sayılı Fikir ve Sanat Eserleri Kanunundaki hükümlere tabidir.
ÖZ
YÜKSEK LİSANS TEZİ

ENDÜSTRİYEL ENZİMLER ÜRETEN YENİ BACILLUS SP. SUŞLARININ
İZOLASYONU VE KARAKTERİZASYONU

Ali COŞKUN

ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ
FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ
BİYOTEKNOLOJİ ANABİLİM DALI

Danışman: Prof. Dr. Numan ÖZCAN
Yıl : 2010, Sayfa: 115

Jüri : Prof.Dr. Numan ÖZCAN
Prof.Dr. Burhan ARIKAN
Yrd.Doç.Dr. B. Devrim ÖZCAN

Bu çalışmada alkalifilik Van Gölü, halofilik Tuz Gölü ve Adana’da yerelması
yetiştiriciliği yapılan topraklardan α-amilaz, ksilanaz ve CMCaz üreten alkalifilik,
halofilik ve termofilik Bacillus sp. su şlarının izolasyonu ve karakterizasyonu
gerçekleştirilmiştir.
Van Gölü’nden izole edilen alkalifilik Bacillus sp. VA-24 suşunun ürettiği α-
amilaz enziminin moleküler a ğırlığı yaklaşık 120 kDa, s ıcaklık ve pH optimumu
sırasıyla 90 °C ve 11.0 olarak bulunmu ştur. Enzim 100 °C’de muhafaza edildi ğinde
aktivitesinin tamamını korumuştur.
Tuz Gölü’nden izole edilen halofilik Bacillus sp. TGB-3 suşunun yaklaşık 52
ve 48 kDa moleküler a ğırlığına sahip ksilanaz ana aktivitesi ile moleküler a ğırlığı
yaklaşık 123 kDa α-amilaz yan aktivitesine sahip iki enzim üretti ği gözlenmiştir.
Halofilik ksilanaz enziminin sıcaklık ve pH optimumu sırasıyla 60 °C ve 7.0 olarak
tespit edilmiştir. Ksilanaz enziminin termostabilitesi 70 °C’e kadar kararl ı olarak
gözlenirken, halofilik α-amilaz enziminin optimum s ıcaklığı ve pH’s ı ise 50 °C ve
7.0 olarak belirlenmiştir.
Adana’da yerelmas ı yetiştiriciliği yapılan topraklardan izole edilen termofilik
Bacillus sp. YET-1 su şunun ürettiği CMCaz enziminin moleküler a ğırlığı yaklaşık
olarak 48 kDa olarak bulunmu ştur. CMCaz enziminin termostabilitesi 90 °C’ye
ulaşırken, optimum sıcaklık ve pH’sı sırasıyla 50 °C ve 7.0 olarak belirlenmiştir.

Anahtar Kelimeler: Bacillus, α-amilaz, CMCaz, ksilanaz, ekstremofil

I
ABSTRACT

M.Sc. THESIS

ISOLATION AND CHARACTERIZATION OF NEW BACILLUS SP.
STRAINS PRODUCING INDUSTRIAL ENZYMES

Ali COŞKUN

DEPARTMENT OF BIOTECHNOLOGY
INSTITUTE OF NATURAL AND APPLIED SCIENCES
UNIVERSITY OF ÇUKUROVA

Supervisor : Prof.Dr.Numan ÖZCAN
Year : 2010, Page: 115

Jury : Prof.Dr. Numan ÖZCAN
Prof.Dr. Burhan ARIKAN
Asst.Prof.Dr. B. Devrim ÖZCAN

In this study, α-amylase, xylanase and CMCase producing alkaliphilic,
halophilic and thermophilic Bacillus sp. strains were isolated from Van Lake with
alkaliphilic soil, Tuz Lake with halophilic soil and Jerusalem artichoke field of
Adana.
Bacillus sp. VA-24 strain of Van Lake, produces the α-amylase with
molecular weight of approximately 120 kDa, temperature and pH optimum of 90 °C
and 11.0, respectively. Thermostability of the enzyme was stable up to 100 °C.
Bacillus sp. strain TGB-3 of Tuz Lake produces two proteins with xylanase
main activity, molecular weight of approximately 52 and 48 kDa and α-amylase (side
activity) with molecular weight approximately of 123 kDa. Halophilic xylanase has
temperature and pH optimum of 60 °C and 7.0, respectively, while halophilic α-
amylase has temperature optimum and pH optimum of 50 °C and 7.0 respectively.
Thermostability of xylanase was determined to be stable up to 70 °C.
Bacillus sp. strain YET-1 produce thermophilic CMCase with molecular
weight of approximately 48 kDa and thermostability of the CMCase were reached up
to 90 °C. Optimum temperature and pH of the CMCase 50 °C and 7.0, respectively.

Key Words: Bacillus, α-amylase, CMCase, xylanase, extremophile

II
TEŞEKKÜR

Bu tez çal ışmasında bana her konuda değerli bilgi ve önerileri ile yol gösteren
ve büyük emek sarf eden dan ışman hocam sayın Prof.Dr. Numan ÖZCAN’a sonsuz
teşekkürlerimi arz ederim.
Ayr ıca tez çalışmasının her aşamasında her zaman yanımda olan; yakın ilgisi,
değerli önerileri ve yard ımlarını benden esirgemeyen say ın hocam Yrd.Doç.Dr. B.
Devrim ÖZCAN’a, Yrd.Doç.Dr. Makbule BAYLAN’a ve Dr. Ali İrfan GÜZEL’e
teşekkürlerimi sunarım.
Yüksek lisans tez jürimde de ğerli fikir ve önerileri ile katkıda bulunan hocam
Prof.Dr. Burhan ARIKAN’a teşekkürlerimi sunarım.
Laboratuar çal ışmaları süresince beraber huzur ve uyum içinde çal ışma
ortamı sa ğlayan çal ışma arkada şlarım Biyolog Dilek TEKDAL’a, Fen Bilgisi
Öğretmeni Atilla ÖZ’e, Ar.Gör. Selçuk ULUSOY’a ve Kimya Mühendisi Esra
YIKAR’a teşekkürlerimi sunarım.
Hayat ımda bir an bile maddi ve manevi desteklerini benden esirgemeyen,
varlıkları ile bana güç veren ve beni bu günlere getiren çok de ğerli AİLEM’e sonsuz
teşekkürlerimi sunarım.

III
İÇİNDEKİLER SAYFA

ÖZ..................................................................................................................................I
ABSTRACT.................................................................................................................II
TEŞEKKÜR................................................................................................................III
İÇİNDEKİLER...........................................................................................................IV
ÇİZELGELER DİZİNİ ...............................................................................................X
TABLOLAR DİZİNİ………………………………………………………………..XI
ŞEKİLLER DİZİNİ ..................................................................................................XII
SİMGELER VE KISALTMALAR...........................................................................XV
1. GİRİŞ………………………………………………..………………………….....1
1.1. Ekstrem Mikroorganizmalar………...…………………..…………………...1
1.1.1. Termofil Mikroorganizmalar…………………………………………..4
1.1.1.1. Termofil Mikroorganizmalar ın Yüksek Sıcaklığa
Dayanıklılık (Termostabilite) Mekanizması.………….……5
1.1.1.2. Termostabil Enzimler ve Önemi……..……………….……...7
1.1.2. Alkalifil Mikroorganizmalar…………………....………………..…….8
1.1.2.1. Areobik Alkalifiller…………………..………...….….…….10
1.1.2.2. Anaerobik alkalifiller………………………………......…...10
1.1.2.3. Haloalkalifiller………………………………………….…..10
1.1.2.4. Halofilik Metanojenler ve Siyanobakteriler……….…..…....11
1.1.3. Halofil Mikroorganizmalar…………………………………..……….12
1.1.3.1. Halofilik Enzim ve Çözünürlüğü……..…………………….14
1.1.3.2. Halofil Mikroorganizmaların
Tuz Toleransları ve Metabolizmaları………..…....…….…...15
1.1.3.3. Halofil Mikroorganizmaların
Biyoteknolojik Açıdan Önemi………………………..….….16
1.2. Endüstriyel Enzimler ve Kullanım Alanları…………………………….….18
1.2.1. Selüloz ve Selülaz (Glukanaz) Enzimleri……………………….……18
1.2.1.1. Selülaz Enzimlerinin Kullanım Alanları……………………22
1.2.2. Ni şasta ve Amilazlar……………………………………..…………..23
IV
1.2.2.1.Amilazların Sınıflandırılması…………..…………..………..24
1.2.2.2. Termostabil Amilazlar………………………………..……..26
1.2.2.3. Termostabil α-amilaz Enziminin
Endüstrideki Kullanım Alanları……………………………..28
1.2.3. Ksilan ve Ksilanazlar………………………………………………....29
1.2.3.1. Mikrobiyal Ksilanazların Bazı Uygulama Alanları…...……31
1.3. Bacillus Cinsi………………………………………………………………35
1.3.1. Bacillus Hücre Morfolojisi ve Hücre Duvarının Yapısı………….…..35
1.3.2. Bacillus Sporları ve Koloni Özellikleri…………………………..…...36
1.4. Araştırmanın Amacı ve Kapsamı……………………………………..……37
2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR…………………………………………………..…..38
2.1. Amilazla İlgili Yapılmış Önceki Çalışmalar………………………………38
2.2. Selülaz (CMCaz)’la İlgili Yapılmış Önceki Çalışmalar…………………...42
2.3. Ksilanazla İlgili Yapılmış Önceki Çalışmalar……………………………..44
3. MATERYAL ve METOT……………………………………………….…..…...47
3.1. Materyal…………………..…………………………………………………..47
3.1.1. Bakteri ve Besiyerleri……………..……………………………….….47
3.1.2. Aletler…………………………………..………………………….….47
3.2. Kullanılan Çözeltiler……………………………………..……………….…..47
3.2.1. NaOH Çözeltisi………………………………………………..……...47
3.2.2. Kongo Kırmızısı (%0.1)………………………………………………48
3.2.3. İyodin Boyası (100 ml).………………………………………………48
3.2.4. NaCl Çözeltisi (1M)…..………………………………………………48
3.2.5. Sodyum-Asetat Tamponu…………………………………….………48
3.2.6. Sodyum-Fosfat Tamponu……………………………………………..48
3.2.7. Tris Tamponu…………………………………..……………..………49
3.2.8. DNS (Dinitro Salisilik Asit) …………………….........................……49
3.2.9. TCA (Trikloroasetikasit) (%20 w/v)……………………………..…...49
3.2.10. SDS-PAGE Stok Solüsyonları………………...………….….……...49
3.2.10.1. 2M Tris HCl (pH 8.8)……………………...……………………...49
3.2.10.2. 1M Tris-HCl (pH 6.8).………………………………..…………...49
V
3.2.10.3. %10 SDS…………………………..…………………….………...50
3.2.10.4. Akrilamid Monomer Solüsyonu
(Solüsyon A) ( %30 akrilamid, %0,8 bisakrilamid)……..………...50
3.2.10.5. %10’luk Amonyum Persülfat………………………….…………..50
3.2.10.6. Örnek Yükleme Tamponu (5X) ……………………………....…..50
3.2.10.7. Elektrod Solüsyonu (1 litre için) ………………………………….50
3.2.10.8. Coomasi Brillant Blue Boyası (CBB) Stok Solüsyonu (1L) ….….50
3.2.10.9. Boyayı Geri Alma (Destaining) Solüsyonu (1L)…………..……...51
3.2.10.10. SDS-PAGE’nde Zimogram Analizleri İçin
Renatürasyon Solüsyonları………………………………...…….51
3.3. Bakteri İzolasyonunda Kullanılan Besiyerleri………………….……...……..52
3.3.1. LB Agar……………………………………..….…………….……….52
3.3.2. LB-CMC-Agar Besiyeri……………………………………………....52
3.3.3. LB-Ksilan-Agar Besiyeri……………….….………………….…...…52
3.3.4. LB-Nişasta-Agar Besiyeri………………………………..…………...53
3.4. Metot……………………………………............................................................53
3.4.1. Bacillus sp. Suşlarının İzolasyonu ve Katı Besiyerlerinde
Enzim Aktivitelerinin Belirlenmesi…………..……………………..53
3.4.1.1. Alkalifilik Bacillus sp. İzolasyonu…………………..……...53
3.4.1.2. Halofilik Bacillus sp. İzolasyonu………..………………….54
3.4.1.3. Termofilik Bacillus sp. İzolasyonu………….……………...55
3.4.2. Enzimlerin Üretimi ve
Kantitatif Enzim Aktivitelerinin Belirlenmesi………………………56
3.4.2.1. Enzimlerin Optimum Aktivite Gösterdi ği Sıcaklık
Değerlerinin Saptanması……………………….……………57
3.4.2.2. Enzimlerin Optimum Aktivite Gösterdiği
pH Değerinin Saptanması…………………………………....57
3.4.2.3. Enzimlerin Termal (Sıcaklık) Stabilitelerinin Saptanması.....57
3.4.2.4. Enzimlerin Değişik Sıcaklıklardaki
Denatürasyon Testi (Suda Çözünürlüğü)………….………..58

VI
3.4.2.5. Steril ve Steril Olmayan Koşullarda Üretilen
Bacillus sp. Suşlarına Ait
Enzim Profillerindeki Değişiklikler…………………………58
3.4.2.6. İzole Edilen Bacillus sp. Suşlarının Substrat Spesifisiteleri..58
3.4.3. Sodyum Dodesil Sülfat Poliakrilamid Jel Elektroforezinde
(SDS-PAGE) Moleküler Ağırlık Tahmini ve Zimogram Analizi…..59
3.4.3.1. SDS-PAGE Sisteminin Haz ırlanması……………..………..59
3.4.3.2. Zimogram Analizi İçin SDS-PAGE
Sisteminin Hazırlanması……………………………………..60
3.4.3.3. Enzim Örneklerinin Jele Yüklenmesi ve Yürütülmesi…...…60
3.4.3.4. SDS-PAGE Jelinin Boyanması ve Zimogram Analizleri..…61
4. BULGULAR VE TARTIŞMA…………….…………………..……………......63
4.1. Bacillus sp. Suşlarının İzolasyonu….......…………….……………..63
4.2. Van Gölün’den Alkalifil Bacillus sp. VA-24
Suşunun İzolasyonu ve Enzim Karakterizasyonu…………..……….63
4.2.1. Alkalifil Bacillus sp. VA-24 Suşunun Ürettiği Enzimler
ve Katı Besiyerinde α-amilaz Enzimi Üretmesi.……..63
4.2.2. Bacillus sp. VA-24 α-amilaz Enziminin
Optimum Sıcaklığı…………………………………...65
4.2.3. Bacillus sp. VA-24 α-amilaz Enziminin
Optimum pH Aralığı………………………………....65
4.2.4. Bacillus sp. VA-24 α-amilaz Enziminin
Termal Stabilitesi………………………………….…66
4.2.5. Bacillus sp. VA-24’ün SDS-Nişasta-PAGE
ve Zimogram Analizi………………………..………...67
4.2.6. Steril ve Steril Olmayan Koşullarda Üretilen
Bacillus sp. VA-24 Suşuna Ait α-amilaz Enzim
Profilindeki Değişiklikler………….....…….………..67
4.2.7. Alkalifilik Bacillus sp. VA-24 Suşuna Ait α-amilaz
Enziminin Değişik Sıcaklıklardaki
Denatürasyon Testi (Suda Çözünürlüğü)………..…...68
VII
4.2.8. Alkalifilik Bacillus sp. VA-24 Suşuna Ait α-amilaz
Enziminin Substrat Spesifisitesi………………….….70
4.3. Tuz Gölün’den Halofil Bacillus sp. TGB-3 Suşunun
İzolasyonu ve Enzim Karakterizasyonu……………..……………..71
4.3.1. Halofil Bacillus sp. TGB-3 Suşunun Ürettiği
Enzimler ve Katı Besiyerinde Ksilanaz Enzimi Üretmesi…..71
4.3.2. Bacillus sp. TGB-3 Ksilanaz Enziminin Optimum Sıcaklığı..73
4.3.3. Bacillus sp. TGB-3 Ksilanaz Enziminin Optimum pH’sı…...73
4.3.4. Bacillus sp. TGB-3 Ksilanaz Enziminin Termal Stabilitesi…74
4.3.5. Bacillus sp. TGB-3’ün SDS-Ksilan-PAGE ve
Zimogram Analizi…………………………………………...75
4.3.6. Steril ve Steril Olmayan Koşullarda Üretilen
Bacillus sp. TGB-3 Suşuna Ait Ksilanaz Enzim
Profilindeki Değişiklikler………………..…………………..76
4.3.7. Halofilik Bacillus sp. TGB-3 Suşuna Ait Ksilanaz
Enziminin Değişik Sıcaklıklardaki
Denatürasyon Testi (Suda Çözünürlüğü)…………….……...77
4.3.8. Bacillus sp. TGB-3 α-amilaz Enziminin
Optimum Sıcaklığı…………………………………………...79
4.3.9. Bacillus sp. TGB-3 α-amilaz Enziminin
Optimum pH’sı……………………………………….……...79
4.3.10. Halofilik Bacillus sp. TGB-3 Suşuna Ait α-amilaz
Enziminin SDS-Nişasta-PAGE ve
Zimogram Analizi…………………………………….……..80
4.3.11. Halofilik Bacillus sp. TGB-3 Suşuna Ait Ksilanaz
ve α-amilaz Enzimlerinin Substrat Spesifisiteleri………..….81
4.4. Yer Elması Yetiştirilen Topraktan Termofil Bacillus sp.
YET-1 Su şunun İzolasyonu ve Enzim Karakterizasyonu………..….82
4.4.1. Termofil Bacillus sp. YET-1 Suşunun Ürettiği Enzimler
ve Katı Besiyerinde CMCaz Enzimi Üretmesi………..…….82
VIII