Compréhension des mécanismes lors de la photocatalyse appliquée à la dégradation des ...

286 Pages·2014·20.77 MB·French

UNIVERSITÉ DE STRASBOURG

ÉCOLE DOCTORALE DES SCIENCES CHIMIQUES
Institut de Chimie et Procédés pour l’Energie, l’Environnement et la Santé,
UMR7515, CNRS, STRASBOURG

THÈSE

présentée par :
Gaëlle CARRE

soutenue le : 30 août 2013

pour obtenir le grade de : Docteur de l’université de Strasbourg
Discipline/Spécialité : chimie/chimie et microbiologie

Compréhension des mécanismes lors de la
photocatalyse appliquée à la dégradation
des microorganismes.
Application au traitement de l’air et aux
textiles auto-décontaminants.

THÈSE dirigée par :
M. KELLER Nicolas ICPEES, CNRS, Université de Strasbourg
M. ANDRE Philippe Faculté de Pharmacie, CNRS, Université de Strasbourg

RAPPORTEURS :
M. PULGARIN César Ecole Polytechnique Fédérale de Lausanne
Mme BAUDA Pascale LIEBE, Université de Lorraine

EXAMINATEURS :
Mme GEOFFROY Valérie Ecole Supérieure de Biotechnologie de Strasbourg
Mme GUILLARD Chantal IRCELYON, CNRS, Université Claude Bernard
Mme GUILLOT-COMBE Emmanuelle Direction Générale de l’Armement
Mme KELLER Valérie ICPEES, CNRS, Université de Strasbourg

MEMBRE INVITE :
Mme LETT Marie-Claire GMGM, CNRS, Université de Strasbourg
« Nulle pierre ne peut être polie sans friction, nul homme ne peut parfaire
son expérience sans épreuve », Confucius
Remerciements

Cette thèse a été réalisée au Laboratoire de Biophotonique et de Pharmacologie sous la
direction de M. Philippe ANDRE et à l’Institut de Chimie et des Procédés pour
l’Environnement, l’Energie et la Santé, sous la direction de M. Nicolas KELLER.

Mes remerciements vont tout naturellement à M. Philippe ANDRE qui au cours de ces
quatre années m’a beaucoup apporté. Toujours disponible, son expertise et son
implication ont largement contribué au bon déroulement de ce projet. Il a su me
transmettre notamment sa passion pour l’enseignement.

J’exprime toute ma reconnaissance à M. Nicolas KELLER pour ses conseils avisés, ses
explications et son soutien dans la réalisation de ce travail.

Je remercie sincèrement Mme Marie-Claire LETT et Mme Valérie KELLER pour leur
contribution et leur implication dans le cadre de ce projet.

Je remercie les rapporteurs Mme Pascale BAUDA et M. César PULGARIN, ainsi que les
examinatrices Mme Valérie GEOFFROY, Mme Chantal GUILLARD, Mme Emmanuelle
GUILLOT-COMBE et Mme Valérie KELLER d’avoir accepté de faire partie de ce jury
de thèse et pour leur temps dédié à l’évaluation de mes travaux.

Mes remerciements vont également à la Direction Générale de l’Armement ainsi qu’à la
Région Alsace pour le financement qu’ils m’ont accordé durant trois années.

Merci à M. Jean-Pierre GIES de m’avoir accueillie dans son laboratoire et merci
également pour sa sympathie.

Je voudrais aussi remercier M. Christian D. MULLER et M. Jean PELUSO pour leur
aide précieuse lors de la mise au point et de l’interprétation des analyses en cytométrie.

Merci également à M. Saïd ENNAHAR et M. Erwann HAMON pour leur contribution et
leur disponibilité lors des analyses d’électrophorèse bi-dimensionnelle.

Je remercie Mme Janina SIEGERT pour la préparation des échantillons de textiles auto-
décontaminants fonctionnalisés. Merci également pour tes explications et ta sympathie.

Merci à M. Thierry ROMERO pour les clichés de microscopie électronique à balayage.

Merci à Mme Nicole GLASSER pour son aide précieuse quant à l’analyse et
l’interprétation des données statistiques.
Merci à Mme Séverine SIGRIST et M. William BIETIGER pour leur participation dans
l’étude de la peroxydation lipidique. Vos conseils techniques furent bénéfiques dans la
réalisation de cette étude.

Merci à Mme Valérie GOEPP et Mme Josiane MOREL-JEAN pour leur bonne humeur et
leur aide dans la préparation de milieux, nettoyage et décontamination des milieux.

Merci également à M. Alain RACH pour la réalisation des dispositifs photocatalytiques
et pour son efficacité.

J’exprime une profonde reconnaissance envers tous mes stagiaires, Anne, Dounia,
Emmanuelle, Florian, Géraldine, Gwenaëlle, Laurent, Maryse, Maxime, Sophie. Merci
pour vos travaux, votre investissement et votre sympathie; vous avez largement contribué
à l’établissement de ce travail.

Enfin je n’oublierai pas mes collègues de travail, Aziz, Anaïs, Anne, Angela, David,
Florent, François, Marlène, Natalie, Nathanaëlle, Nazha, Nizar, Olivier, Pierre-
Alexandre, Quentin, Romain, Shabnam, Thomas, Yas…

Mes sincères remerciements sont également adressés à mes amis et à ma famille pour
leur soutien indéfectible.

Enfin un grand merci à mon cher et tendre, pour son soutien quotidien et en particulier
dans cette tâche.

Nombreuses sont les personnes que j’ai rencontrées durant ces quatre ans, ce fut un réel
enrichissement personnel tant sur le plan professionnel que sur le plan amical.

En définitive, merci à toutes les personnes qui ont contribué à la réalisation de ce travail,
de près ou de loin.
Liste des abréviations

2D : Bidimensionnel
AFNOR : Association Française de Normalisation
ANSM : Agence Nationale de Sécurité du Médicament et des produits de santé
ATCC : American Type Culture Collection
BLSE : Bactéries à Gram négatif productrice de béta-lactamase
BPF : Bonnes Pratiques de Fabrication
BVNC : Bactéries Viables Non Cultivables
CHU : Centre Hospitalier Universitaire
CIP : Collection de l’Institut Pasteur
CLIN : Centre de Coordination de la Lutte contre les Infections Nosocomiales
COV : Composé Organique Volatil
DO : Densité Optique à 620 nm
620
Eau φ : Eau physiologique
HEPA : High Efficiency Particulate Air
IRH : Institut de Recherche Hydrologique
LB : Luria Bertani
LPS : Lipopolysaccharide
MEB : Microscopie Electronique à Balayage
MH : Mueller Hinton
OMS : Organisation Mondiale de la Santé
PEI : Polyéthylèneimine
PIE : Point isoélectrique
PMT : Photomultiplicateur
PSS : Polystyrène sulfonate
PZC : Point de charge nulle
SARM : Staphylococcus aureus résistant à la méticilline
SDP : Sous Produits de Désinfection
SRAS : Syndrome Respiratoire Aigu Sévère
TiO : Dioxyde de Titane
2
TS : Trypticase Soja
U : Unité Enzymatique
U.A. : Unité Arbitraire
UFC : Unité Formant Colonie
UFP : Unité Formatrice de Plage
UV: rayonnement Ultra-Violet
VRE : Entérocoque Résistant à la Vancomycine
ZAC : Zone à Atmosphère Contrôlée
Table des matières

Introduction générale ....................................................................................... 1

Chapitre 1 : Revue générale ............................................................................ 5
I. Contamination biologique multi-environnementale ................................. 6
1. Préambule sur le monde bactérien .................................................................................7
2. Contamination biologique de l’eau ................................................................................8
3. Contamination biologique à l’interface eau/surface : les biofilms................................. 10
4. Contamination biologique des surfaces ........................................................................ 13
5. Contamination biologique de l’air : les bioaérosols ...................................................... 16
II. Les systèmes de désinfection, décontamination, dépollution ................. 20
1. Systèmes de désinfection de l’eau ................................................................................ 20
2. Systèmes de décontamination de l’air .......................................................................... 21
3. La désinfection des surfaces ........................................................................................ 23
III. La photocatalyse hétérogène : un Procédé d’Oxydation Avancée ........ 25
1. Principe de la photocatalyse hétérogène ....................................................................... 25
2. Les matériaux photocatalytiques .................................................................................. 27
3. Désinfection/décontamination par photocatalyse ......................................................... 33
IV. Aspects mécanistiques de la photocatalyse appliquée à la
dégradation des microorganismes ........................................................... 52
1. Effet des rayonnements UV-A sur les microorganismes............................................... 52
2. Importance du contact entre le TiO et les bactéries ..................................................... 53
2
3. Rôle des ROS sur le mécanisme de destruction bactérien ............................................. 54
4. Principaux composants cellulaires modifiés lors de la photocatalyse ............................ 55
5. Mécanismes enzymatiques de détoxification des réactifs oxygénés .............................. 59
6. Influence de la nature du microorganisme : bactéries, spores et champignons .............. 62
V. Etude de la toxicité du TiO (sous forme de nanoparticules) ................. 64
2

Chapitre 2 : Partie Expérimentale ................................................................ 66
I. Photocatalyseur de choix : le TiO P25 Evonik (Degussa) ..................... 67
2
II. Dispositifs expérimentaux de test ............................................................ 69
1. Système d’irradiation UV-A ........................................................................................ 69
2. Chambre solaire .......................................................................................................... 72
3. Réacteurs, surfaces et milieux photocatalytiques.......................................................... 74
III. Présentation des bactéries sélectionnées pour notre étude multi-
environnementale ..................................................................................... 75
IV. Préparation d’une suspension bactérienne ............................................. 76
V. Analyse statistique .................................................................................... 77
Chapitre 3 : Evaluation de l’action antimicrobienne de la photocatalyse
sur surface et en milieu liquide ................................................ 78
I. Etude sur surface...................................................................................... 79
1. Screening de l’effet de différents traitements sur le développement d’une vingtaine
de microorganismes avec TiO en milieu nutritif ......................................................... 79
2
2. Etude de la réduction bactérienne avec dépôts de TiO sur verre .................................. 96
2
3. Influence et représentativité du mode d’évaluation sur surface ................................... 106
II. Etude en milieu liquide .......................................................................... 116
1. Réacteurs photocatalytiques, préparation des tests et modes opératoires .................... 117
2. Détermination de l’intégrité membranaire en milieu liquide par cytométrie
capillaire ................................................................................................................... 121
3. Détermination de la viabilité cellulaire en milieu liquide par dénombrements sur
milieux gélosés nutritifs ............................................................................................. 155
4. Comparaison des deux méthodes de détermination de la viabilité cellulaire ............... 159

Chapitre 4 : Etude des mécanismes d’oxydation ainsi que leur effet sur
les différents composants cellulaires après traitements
photocatalytiques .................................................................... 165
I. Mise en évidence des radicaux anions superoxydes par
Chimiluminescence. Implication dans l’effet antibactérien du TiO ... 166
2
1. Principe de la chimiluminescence .............................................................................. 167
2. Principe de l’ajout de molécules scavengers .............................................................. 169
3. Influence de la durée de vie des ROS photogénérées et prise en considération des
limites du système ..................................................................................................... 170
4. Préparation du milieu réactionnel et modes opératoires pour le suivi de CL lors des
tests ........................................................................................................................... 171
5. Suivi de CL en absence de microorganisme ............................................................... 174
6. Suivi de CL en présence de microorganismes et de SOD et d’O °- dans l’effet
2
antibactérien de la photocatalyse sur TiO ................................................................. 180
2
II. Détermination de l’action des ROS sur les lipides ................................ 185
1. La peroxydation lipidique : généralités ...................................................................... 185
2. Préparation des tests et modes opératoires ................................................................. 186
3. Implication du radical anion superoxyde O °- (via l’ajout de SOD) dans les
2
phénomènes de peroxydation lipidique ...................................................................... 189
4. Peroxydation lipidique et viabilité cellulaire déterminée par cytométrie capillaire et
dénombrement sur milieux gélosés ............................................................................ 192
III. Etude des modifications protéiques par analyse d’électrophorèse bi-
dimensionnelle couplée à de la spectrométrie de masse ....................... 194
1. Préparation des tests et modes opératoires ................................................................. 195
2. Résultats .................................................................................................................... 199
IV. Confrontation des différentes analyses réalisées (suivi de CL,
peroxydation lipidique, modification protéomique, perte de
l’intégrité membranaire et mise en évidence de l’effet bactéricide)
chez E.coli ............................................................................................... 210

Chapitre 5 : Mise en œuvre du TiO dans des applications
2
photocatalytiques .................................................................... 216
I. Dispositif de traitement de l’air équipé de diodes
électroluminescentes (DELs).................................................................. 217
1. Description des modules photocatalytiques ................................................................ 218
2. Protocole de test sur phages T2 de E.coli ................................................................... 222
3. Résultats .................................................................................................................... 223
II. Développement de textiles fonctionnalisés photocatalytiques à
activité auto-désinfectante sous lumière solaire .................................... 227
1. Fonctionnalisation Layer-by-Layer et techniques de caractérisation des textiles ......... 228
2. Protocoles des tests .................................................................................................... 232
3. Résultats .................................................................................................................... 237
4. Conclusion ................................................................................................................ 248

Conclusions et perspectives.......................................................................... 251
Introduction générale
Introduction générale
Les travaux développés dans cette thèse ont pour objectif principal de participer à la
compréhension des mécanismes impliqués lors de la dégradation des microorganismes par
photocatalyse, et notamment d’étudier l’influence du mode d’évaluation et des protocoles de
test sur la détermination des propriétés antimicrobiennes obtenues par photocatalyse sur TiO .
2

L’utilisation d’agents biologiques comme armes de guerre remonte à l’Antiquité. La
contamination intentionnelle des aliments et de l’eau avec des carcasses d’animaux, ou via
l’utilisation de bioaérosols avaient pour but de rendre malade les adversaires. Bien que la
production d’armes biologiques soit dénoncée par la Convention sur l’interdiction des armes
biologiques (1972) et que leur utilisation soit interdite par le protocole de Genève (1925), il
n’est pas à exclure d’éventuelles attaques bioterroristes générant de multiples effets
dévastateurs sur la population (économique, culturel ou médical). Cette crainte a été fortement
ravivée en 2001, lors d’attaques bioterroristes avec les enveloppes piégées à l’anthrax. Les
voies d’attaques potentielles sont diverses comme par exemple : l’aérosolisation des
microorganismes pathogènes, la contamination des eaux, des aliments, les phénomènes de
contamination croisée… Ainsi, dans l’objectif d’une meilleure préparation et d’une meilleure
réponse à ces attaques, des stratégies doivent être élaborées et développées.

En parallèle, l’émergence des bactéries multi-résistantes (BMR) aux antibiotiques en milieu
hospitalier constitue un réel problème de santé publique. L’utilisation intensive et continuelle
des antibiotiques participe à cette pression de sélection des gènes de résistance. Les
principaux pathogènes, Staphylococcus aureus résistant à la méticilline (SARM),
Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii et les entérobactéries (Escherichia coli,
Klebsiella pneumoniae…) sont bien trop souvent incriminés dans les infections nosocomiales.
En milieu hospitalier, les règles d’hygiène et de désinfection sont strictes avec des procédures
établies. Cependant, dans certains services (grands brûlés, réanimation…), la prévalence des
infections nosocomiales reste trop élevée. Afin d’éradiquer ces microorganismes, de
nouvelles méthodes de décontamination doivent être envisagées et la photocatalyse
hétérogène constitue une alternative prometteuse qui a déjà fait l’objet de nombreux travaux.

La photocatalyse hétérogène fait partie des procédés d’oxydation avancée et peut être
appliquée aussi bien à la désinfection de l’eau et de l’air qu’à la mise au point de surfaces,
matériaux auto-nettoyants et auto-décontaminants. Relativement non sélective, la
photocatalyse est également utilisée pour l’élimination et/ou la dégradation des polluants
chimiques (pesticides, colorants, composés organiques volatils (COV)…). Ce procédé de
désinfection/dépollution est présenté comme une technologie prometteuse avec un spectre
d’applications potentielles ou déjà existantes, très large, et qui bénéficie notamment d’une
mise en œuvre douce (à température ambiante et pression atmosphérique), propre et verte
(source d’énergie peu ou pas polluante, absence de produits chimiques oxydants et de rejets
polluants), peu coûteuse et aisée.

Dans le cadre de cette thèse cofinancée par la Direction Générale de l’Armement (DGA) et la
Région Alsace, l’étude de la désinfection par photocatalyse hétérogène a été
préférentiellement menée sur des microorganismes pouvant être impliqués lors d’attaques
1