Table Of Content昆 虫 学 报 !"#$%&#’(’)’*+"$,+&+"$，!"#$%&$’())*，+（, (）：,()-,(+ .//0)1+123(43
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棉铃虫细胞色素 基因
!"#$ !"#%$&’
上游区的克隆及序列分析
#()
周颖君，杨亦桦，武淑文，吴益东!
（南京农业大学植物保护学院昆虫学系，农业部病虫监测与治理重点开放实验室，南京 (,))4+）
摘要：细胞色素L1+)基因 -./4!,(的过量表达已被证实与棉铃虫 01)+’"2134$ $3(+*13$对拟除虫菊酯的抗性相关。
为探明棉铃虫 -./4!,(基因的表达调控机理，根据棉铃虫 -./4!,(基因@M0B全长的+N2末端核苷酸序列，采用基
因组步移方法，获得 -./4!,(的+N2上游区序列（总长为5+6+#F）。与@M0B序列进行比对，表明在起始密码子上游
5#F处有一长为(,(1#F的内含子。利用00LL分析软件预测出转录起始位点，与根据 -./4!,(全长@M0B序列推
测的结果是一致的。O!/7BJPQ,R5软件分析转录因子结合位点的结果显示，该序列不仅包含启动子的核心结构
序列———OBOB2#=S和PBBO2#=S，亦包含多个转录因子结合位点，如TBOB2,，PGSB，MDG等。本研究结果为深入研究
棉铃虫 -./4!,(的表达调控机制及其参与杀虫剂抗性的分子机理奠定了一定基础。
关键词：棉铃虫；细胞色素L1+)；PUL4B,(；基因组步移；+N2上游区
中图分类号：V43+ 文献标识码：B 文章编号：)1+123(4（3 ())*）)(2),()2)3
*+,-.-/ 0-1 23453-63 0-0+72.2 ,8 9:3 #()5;29<30= <3/.,- ,8 679,6:<,=3 !"#$
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B37 C,<12：01)+"’2134$ $3(+*13$；@’C=@<$=8" L1+)；-./4!,(；Z"A=8" H&:b9AZ；+N2%FEC$"&8 $"Z9=A
细胞色素 L1+)单加氧酶系是昆虫体内重要的 L1+)单加氧解毒酶量增加，从而导致昆虫对杀虫剂
解毒酶，L1+)单加氧酶解毒活性增强是昆虫对杀虫 产生抗性。已在多种昆虫中证实 L1+) 基因的组成
剂产生抗性的重要机理（/@=CC，,444）。对杀虫剂具 型过量导致昆虫产生抗药性，如 -./3!, 与家蝇对
有降解能力的一个或多个 L1+) 基因的过量表达使 M9&;9A=A的抗性，-./36, 与家蝇对拟除虫菊酯的
基金项目：国家自然科学基金项目（5)16,,+1）；高校博士点专项基金（())1)1)6)((）
作者简介：周颖君，女，,4*(年6月生，江苏南通人，硕士研究生，研究方向为昆虫分子毒理学，728&9:：;<=%;<=%*(65>’&<==?@=8?@A
!通讯作者 B%C<=$D=$@=$$"EF=AG"A@"，728&9:：H’G>AI&%?"G%?@A
收稿日期 J"@"9K"G：())62)32),；接受日期 B@@"FC"G：())62,(2(1
,期 周颖君等：棉铃虫细胞色素45.- !0132",基因.MN上游区的克隆及序列分析 ","
抗性，!"#!$" 与果蝇对 ##$ 等多种药剂的抗性 （:FL& #’OPF)(&），在不接触任何药剂下用人工饲料饲
（%&’&(&)*&+，,--.）。 养，对各种化学农药均敏感。棉铃虫幼虫采用人工
棉铃虫 %&’()*+&,#- -,.($&,-（/01+&(）寄主范围 饲料饲养，温度,EQ R"Q，光周期 "!CS2#，成虫饲
广泛，能为害棉花、玉米、小麦、大豆、花生、蔬菜等多 以"-T蔗糖水。
种农作物，是一种世界性的重要经济害虫。,-世纪 !"# 棉铃虫基因组$%&提取、纯化与质量鉴定
2-年代初期，高效、低毒的拟除虫菊酯类杀虫剂被 取单头棉铃虫.龄幼虫（约,-- =8），加入含.--
广泛用于防治棉铃虫；"323年以前棉铃虫对拟除虫 !C.T K#K的裂解缓冲液，充分研磨后用苯酚、氯仿
菊酯一直比较敏感，但此后中国各棉区的棉铃虫对 反复抽提，"5 ---U 8离心 "- =)+，再加入 .-- C苯
!
拟除虫菊酯都产生了不同程度的抗性，并成为上世 酚，"5 --- U 8 离心 "- =)+，移取上清液至一新
纪3-年代初我国华北棉区棉铃虫特大发生的关键 VBB&+WF(X管中，加入 .-!C EY. =FHZC 醋酸铵和 2--
因子之一（沈晋良和吴益东，"33.）。大量生物测定 !C冰乙醇，置于冰上". =)+。挑取悬浮状#?@到一
和生化研究结果表明，棉铃虫对拟除虫菊酯产生抗 新 VBB&+WF(X管中，加入 .-- C E-T冰乙醇洗涤，干
!
性的主要机理为细胞色素 45.- 介导的氧化解毒作 燥以去除乙醇，加入 !-[ "--!C WW/,\ 悬浮 #?@。
用增强（吴益东等，"33.；67+8 &/ -’9，,--5；:;&+ &/ 取, C棉铃虫基因组#?@，进行琼脂糖凝胶电泳鉴
!
-’9，,--.；67+8 &/ -’9，,--.）。棉铃虫对氰戊菊酯 定其完整性。利用紫外分光光度计测定其浓度，并
的抗性品系（6<%）与同步饲养、未用药剂处理的对 将终浓度调整至-Y" 8ZC，],-Q保存备用。取. C
!
照品系（6<）相比，!0132", =>?@表达量在!龄幼 棉铃虫基因组 #?@，加入 "Y!!C 4,-"（"U"-]. ^Z
虫脂肪体中增加了 A25 倍，在中肠中则增加了 "3 C），,!C "-U 4,-"1DXX&(和 ""Y5!C WW/,\，轻轻混
倍，从而在分子水平上初步证实了棉铃虫 6<%品系 匀，AEQ孵育"!["2 ;后，以未酶切的棉铃虫基因组
对拟除虫菊酯的高水平抗性与 !0132", 等基因的 #?@及 _7(I&( 为参照，进行琼脂糖凝胶电泳，鉴定
过量表达有关（杨亦桦，,--.；67+8 &/ -’9，,--!）。 其纯度。
昆虫 45.-基因过量表达是由于基因转录增强 !"’ 棉铃虫基因组步移
或=>?@更稳定或二者共同作用的结果（%&’&(&)*&+， 所有操作按照 ^+)P&(*7H <&+F=& ‘7HI&($_ a)（L 美
"333）。果蝇 !"#!$"的过量表达是由于在抗性品系 国 :HF+L&J;公司）说明书进行。具体过程简述如下。
!"#!$"转录起始位点上游 ,3" 1B 处插入了一个 !"’"! #?@文库的构建：用 4,-"、5)*>#、1+6$
2))*,3逆转录转座子的长末端重复片段（C$>） 和 7/6"5种限制性内切酶分别对棉铃虫 K:#品系
（:;D+8 &/ -’9，,--E）。因此，分离、鉴定参与细胞色 幼虫基因 #?@ 进行消化后，用 #?@ 产物纯化试剂
素45.-调控的顺式作用元件和反式作用因子已成 盒回收酶切产物。然后，在5 C已纯化的酶切消化
!
为目前在45.-研究领域的热点之一。 产物中，分别加入 "Y3 C <&+F=& ‘7HI&( 接头（,.
!
基因组步移法（8&+F=& G7HI)+8）是一种利用从基 =FHZC）、"Y! C . U $5 连接酶缓冲液和 -Y. C $5
! ! !
因组中获得已知序列（J#?@或基因组 #?@）的侧翼 #?@连接酶（"U"-]! ^ZC），轻轻混匀后置于"!Q孵
序列的方法，常用于获取已知 J#?@ 序列的基因的 育"!["2 ;，E-Q . =)+以终止反应，并加入 E, C
!
启动子或其他上、下游调控序列的克隆（K)1&(L &/ $V（B/EY.）缓冲液，轻轻混匀。至此构建了 5 种连
-’9，"33.）。本研究根据 !0132", 基因 J#?@编码 有接头的棉铃虫基因组步移 #?@文库，置于],-Q
区.MN末端核苷酸序列设计特异性引物，运用基因组 保存备用。
步移的方法，成功获得其上游启动子区，为下一步深 !"’"# 第一次基因组步移：根据 !0132", 基因
入研究棉铃虫细胞色素 45.- 基因过量表达的调控 J#?@序列（<&+b7+I登录号为 @6AE"A"2）的.MN核苷
机制奠定了一定基础。 酸序列设计两个反向特异引物（‘"3@",N<K4" 和
‘"3@",N<K4,）用于基因组步移（引物位置详见图
! 材料与方法 "），分别以 5 种 #?@ 文库为模板，用 @4"Z‘"3@",N
<K4"这对引物首先进行第"轮 4:>反应后，然后用
!"! 供试昆虫 @4,Z‘"3@",N<K4,进行第,轮 4:>扩增；对获得的
棉铃虫 K:#敏感品系为德国拜耳公司提供，该 最长的目标片段进行克隆和测序。引物序列详见表
品系于,- 世纪 E- 年代采自非洲西部的科特迪瓦 "，其中引物@4N"、@4N,均由试剂盒提供。
’%% 昆虫学报 $,2’342-0-*-1+,’5+4+,’ E’卷
!"#"# 第二次基因组步移：根据第一次基因组步 反应、质粒!"#的提取、纯化、酶切等操作步骤均参
移获得的 !"# 片段的序列设计特异性反向引物 照相应的试剂盒说明书。!"# 测序由上海英骏公
（$%&#’%()*+’、$%&#’%()*+%），进行第二次基因组 司完成。
步移，步骤同上，对获得的最长的目标片段进行克隆 !"( 序列分析
和测序。 用""++在线分析软件（9::;：<<===>?5@A:?B4>658<
!"$ %&’产物回收克隆测序 31C :66B3<;5676:15>9:7B）预测 !"#&$’%基因 EF(上游
D
获得的 +,-产物用凝胶回收试剂盒（安徽优晶 区的转录起始位点。用 0G*.#-,H ’IJ软件（9::;：<<
公司）进行纯化回收，将纯化的目标片段克隆至 ===>KL5K>M;<513125K9<NL<0G*.#-,H>9:7B）预测 !"#&$’%
+)./(01234载体（+567182 公司）。连接反应、转化 基因上游非编码区域内各转录因子结合位点。
图’ 本研究所设计的引物位置示意图
GA8> ’ *K9172:AKNA285276?;63A:A6O36?;5A7153@31NAO:913:@N4
$2BP’为第一次步移，$2BP%为第二次步移，黑方格为接头。$2BP’A3:91?A53:=2BPAO8512K:A6O，
$2BP%A3:9131K6ON=2BPAO8512K:A6O，LB2KPL6Q712O3:912N2;:15>
表! 用于扩增棉铃虫 !"#)$!*基因(+,上游区的引物
-./01! %2341256517389:15967;<=2.4>03<3?.93=8=<
(+,6>5921.421@3=8=< !"#)$!*
引物名称 引物序列
+5A715O271 +5A715L231（EFRJF）
#+(’ )0##0#,)#,0,#,0#0#))),
#+(% #,0#0#))),#,),)0))0
$’&#’%()*+’ #,),,#0#,,)#)#)##,,0,)#)0#)
$’&#’%()*+% ,),,#,,,#)#,,#))#,0#)0#0,#0
$%&#’%()*+’ 0),,0)#,),0##,,,,,,00#))##0
$%&#’%()*+% 0)),,,###)0),0))0))##0),#,0
* 结果与分析
*"! 棉铃虫基因组ABC分离与鉴定
将分离纯化的棉铃虫基因组 !"#进行琼脂糖
凝胶电泳，显示出一条边缘整齐清晰的 !"# 条带 图% 棉铃虫基因组!"#完整性和纯度的鉴定
GA8> % UN1O:A?AK2:A6O6?AO:185A:42ON;@5A:46?
（图%：’），表明所提取的棉铃虫基因组 !"#非常完
81O67AK!"#6? ()*+,-.)&/’’&0+1)&’
整。另外，经 %&’!酶切消化的棉铃虫基因组 !"# /：!"#分子量标记!"#725P15；’：基因组!"#)1O67AK!"#；
（图%：%）呈均匀涂布状，表明所提取的棉铃虫基因 %：%&’!酶切的基因组!"#!A813:1N81O67AK!"#L4 %&’!>
组!"#的纯度已满足限制性内切酶消化的需要。 为J EVE L;的!"#片段。该 !"#片段JF端的序列
因此，已制备的棉铃虫基因组 !"#的完整性和纯度 与 !"#&$’%基因 K!"# EF端序列一致，说明该片段
可以满足下一步构建基因组步移!"#文库的要求。 确实是 !"#&$’% 基因上游的启动子区。经与
*"* %$(D基因 !"#)$!* (+,上游区序列的获得 )1OW2OP中 !"#&$’%的 K!"# 序列比对发现位于起
通过第一次步移，获得长度为 % &S% L;的 !"# 始密码子上游J L;处具有一段长为%’%S L;的内含
片段；通过第二次步移，又获得长度为 TTJ L; 的 子（图J，S）。
!"#片段；将所获两段序列进行拼接，共获得一长
%期 周颖君等：棉铃虫细胞色素"<&: !"##$$%基因&*+上游区的克隆及序列分析 $%6
!"# $%&’基因 !"#($)! &*+上游区序列的分析 有启动子的基本转录元件：1)1)+’78位于96: ’(，
利用 !!"" 在线分析软件分析 !"##$$% 基因 9 %6$ ’(， 9 %;6 ’(， 9 #:% ’(， 9 $ %&< ’( 和
起始密码子上游序列，预测出转录起始位点为位于 9$ %=% ’(处；-))1+’78 位于 9 6;6 ’(，9 =%> ’(，
起始密码子上游 % %&# ’(处的碱基 )，这与普遍发 9#&= ’(，9$ :;< ’(和9$ %6> ’(处。进一步分析
现的转录起始位点为 )相一致，同时与用 &*+,)-. 表明，该基因的 &*+上游区（包括内含子区域）存在
获得的 !"##$$%全长/0!)的&*+端序列是相同的。 ?)1)+$，?)1)+%，-@8)，-A.B"，0C@，D/E+$和-,.A
用123.),-4$56 软件分析此序列，发现该序列具 B"等多种转录因子结合位点（图6，<）。
图6 棉铃虫细胞色素"<&: !"##$$%基因&*+上游区的序列
2FGH 6 1IJ&*+K(LEMJNOMJGF7PLJQKJP/J7C %&’()*+&,-..,/(0&,. /RE7/IM7OJ"<&: GJPJ !"##$$%
S?19 9 9 9)?S部分为内含子区域；加黑、下画线序列为转录因子结合位点；下图同。
S?19 9 9 9)?S FP@F/NEJLEIJFPEM7PNMJNH 3JQKJP/JLFP’7T@NP@KP@JMTFPJ@NMJ
EMNPL/MF(EF7PJTJOJPE’FP@FPGLFEJLH 1IJLNOJC7MEIJC7TT7UFPGCFGKMJH
转录活性（VNEFPWF/ &1 .’H，%::<；XKMN &1 .’H，%::<），
# 讨论 但也有研究表明 ?)1) 会抑制基因的表达（VF &1
.’H，$##;；!JMT7Y &1 .’H，%:::）。依赖细胞类型及环
对棉铃虫细胞色素 "<&: !"##$$%基因的上游 境的变化，D/E+$可增强或抑制基因的转录（DG’7KMPJ
调控序列分析表明，该序列不仅包含启动子的核心 NP@ )PENTFL，$##;）。-@8) 元件一般位于基因的 &*+
结构序列，亦包含一些特异的反应元件和转录因子 端，作为启动子的一部分起作用，在表达 -@8)蛋白
结合位点。1)1)框具有将,!)聚合酶!引导到正 的报告基因表达系统中，载体中含有的 -@8) 元件
确转录起始位点的功能，从而使转录精确地开始，而 能够增强基因的转录活性（XNMGNTFE &1 .’H，$##6；
-))1框是调控转录速率的元件。而其他一些转录 -INPG &1 .’H，%::<）。-A.B"、1)1)+’78 的点突变均
因子结合位点（包括 ?)1)+$，?)1)+%，-@8)，-A 可使 ’&-1(2 基因启动子的活性降低 $: 倍（XNL7P &1
.B"和D/E+$等转录因子结合位点）则可能具有特异 .’H，$##;）。0C@ 因 子 一 般 与 发 育 调 控 有 关
性调节基因转录的功能。有研究表明，多个 ?)1) （X/?FPPFL NP@ ZMKOTNK，$##%；,7MEI，$##<）。另外，
转录因子结合位点共同调控会显著增加报告基因的 本研究中还发现在 &’+调控序列的内含子中亦存在
&’! 昆虫学报 $)1.<61*/*’*0().7(6(). #&卷
图! 棉铃虫细胞色素"!#$ !"#%$&’基因#()非翻译区中内含子的序列
*+,- ! ./01/23/45678/+27952:+78+278/#();<=9/,+5256
%&’()*+&,-..,/(0&,. 3>753895?/"!#$ ,/2/ !"#%$&’
着许多转录因子结合位点，推测其上的调控位点可 术来分离与已知序列毗邻的未知 J@A序列的方法，
能同样具有特异性调节基因转录的功能。许多真核 较传统的基因组J@A文库筛选法要简便、快捷。通
生物基因启动子内部存在内含子，改变这些内含子 过多步骤的基因组步移，不仅可以填补基因组图谱
可能影响基因表达的效率以及 ?=@A 的稳定性 之间的空隙，对获得由传统文库筛选法丢失的克隆
（BC9DC9+25 &1 .’-，&%%#）。多种植物 #*’234(53(1(6 基 也非常有用。本实验运用基因组步移方法成功地从
因启动子中的内含子被证明与基因的表达相关 棉铃虫中克隆出细胞色素 "!#$基因 !"#%$&’上游
（E+2/7 &1 .’-，&%%&；B/2438+F &1 .’-，&%%!；BC9DC9+25 调控序列，并利用软件预测出多种顺式作用元件，为
&1 .’-，&%%#；"G/44/ &1 .’-，&%%H）。 今后的功能验证研究奠定了一定基础。
与其他真核生物的基因一样，细胞色素 "!#$基
参 考 文 献（!"#"$"%&"’）
因的转录调控一般通过顺式作用元件与反式作用因
子复杂的相互作用来实现。每个 "!#$ 基因上都有 E+2/7K@，L/M/7+7K，N/+GOP，&%%&Q A2CG>4+456C4126G5:/9M5G>1D+01+7+2
许多特定的顺式作用元件，并主要分布于基因的#() M95?57/9D>79C24+/27/RM9/44+52- #’.617)(-，H%：SHT%!Q
上游调控区，基因的各种顺式作用元件则构成多种 I8C2,KP，I851IK，P4+/8 UI，L1 VI，J/W+KX，I8C2,O"，X15<*，
不同组合模式，使与之相对应的各反式作用因子相 P1C2, IO，’$$!Q VY/27+6+3C7+52 56 #()1M479/C? 9/,+52 56 M166/96+48
9+D545?CGM957/+2 L’% ,/2/ C4 C 47952, 35247+717+W/ M95?57/9 75 Y9+W/
互作用，共同完成对"!#$基因转录的有效控制。启
B*" /RM9/44+52 +2 Z/D9C6+48- 8(*)9&/- 8(*-92:- ;&:- !*//36-，
动子的克隆是对基因表达调控进行研究的必要条
[&!：’!%T’#SQ
件。基因组步移技术是克隆基因启动子区域最常用 I8/2 .，UC2, UP，N1 UJ，’$$#Q I599/GC7+52 D/7://2 6/2WCG/9C7/
亦是最有效的方法，它是一种新发展的利用 "I=技 9/4+47C23/ C2Y 3>753895?/ "!#$ ?/Y+C7/Y \)Y/?/78>GC7+52 C37+W+7> +2
J期 周颖君等：棉铃虫细胞色素F0PK 1F<.7OJ基因P^D上游区的克隆及序列分析 OJP
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’()7A+($#’$&7- >#&&?，.P：JP012JPPO4 （责任编辑：黄玲巧）
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