Table Of Content云 南 植 物 研 究 2005, 27 (6) : 653～656
Acta Botanica Yunnanica
应用 SDS-PAGE 分析和 PCR 鉴定长发带芒草的
高分子量谷蛋白亚基
颜泽洪 , 代寿芬 , 刘登才 , 魏育明 , 郑有良
(四川农业大学小麦研究所, 四川 都江堰 611830)
摘要: 利用 SDS-PAGE 分析、PCR 扩增和序列测定与分析研究了长发带芒草 ( Taeniatherum
crinitum) 的高分子量谷蛋白亚基及其基因。结果显示, 长发带芒草中发现的高分子量谷蛋白
亚基与普通小麦中的类似, 但迁移率存在较大差异。其中, x型亚基均比 Dx2 亚基迁移率小
或接近, y型亚基均比 Dx12亚基迁移率更快。本研究结果揭示了带芒草属具有与普通小麦
类似的高分子量谷蛋白亚基, 这些亚基在小麦品质遗传改良中具有潜在的利用价值。
关键词: 带芒草属; 高分子量谷蛋白亚基; SDS-PAGE 分析; PCR扩增; 序列分析
中图分类号: Q 946 文献标识码: A 文章编号: 0253- 2700(2005)06 - 0653- 04
Characterization of HMW Glutenin Subunits from
Taeniatherum crinitum by SDS-PAGE and PCR
YAN Ze-Hong, DAI Shou-Fen, LIU Deng-Cai, WEI Yu-Ming, ZHENG You-Liang
( Triticeae Research Institute, Sichuan Agricultural University, Dujiangyan 611830, China)
Abstract: HMW glutenin subunits and genes in Ta. crinitum were investigated by using SDS-PAGE and
PCR technology . The results suggested that HMW glutenin in Ta. crinitum were very similar but not iden-
tical to those ofwheat especially in terms of electrophoresis mobility . The electrophoresis mobility of the x
type subunits of Taeniatherum was slower or closer to that of Dx2 of wheat, and of y type subunits were
faster than that of Dy12 ofwheat . Our results indicated that Taeniatherum species may contain HMW glu-
tenin subunits similar to those of wheat and that the Taeniatherum subunitsmay have the potential value for
improving the end use qualities of wheat .
Key words: Taeniatherum; HMW glutenin; SDS-PAGE analysis; PCR amplification; Sequences analysis
高分子量麦谷蛋白是小麦及其近缘物种中的一种非常重要的种子贮藏蛋白, 与种子的
生理功能密切相关, 为种子发芽提供能量储备 (Peter 等, 1995)。其组成和含量对小麦面
粉的加工品质具有至关重要的决定作用。
在普通小麦中, 高分子量麦谷蛋白基因位于第 1 同源群染色体 1A、1B 和 1D 长臂上
基金项目: 教育部优秀博士论文作者专项基金、四川省青年科技基金、四川省科技厅应用基础项目
收稿日期: 2005- 04-06, 2005-05- 08 接受发表
作者简介: 颜泽洪 (1970-) 男, 副研究员, 主要从事小麦遗传育种。Tel Fax: 028-87283949
E - mail: [email protected]
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的 Glu-A1, Glu-B1 和 Glu-D1 位点, 统称为 Glu-1 (Lawrence and Shepherd, 1981; Payne 等,
1980)。每个基因位点内包含两个紧密连锁的基因, 分别偏码一个分子量较大 x 亚基和分
子量较小 y 亚基 (Payne 等, 1980, 1982)。由于基因沉默效应, 普通小麦品种中通常有 3
～5 个可以表达的高分子量谷蛋白亚基 (Payne 等, 1980, 1982)。每一个基因位点内的 x
和 y 型亚基又有多种等位变异形式 (Payne 等, 1980, 1982)。
带芒草属 ( Taeniatherum Nevski, 染色体组 TaTa, 2n = 2x= 14) 是小麦族的成员之一,
小麦的近缘属。为一年生草本植物, 是一种重要的牧草。分布在法国南部、意大利、匈牙
利、保加利亚、罗马尼亚、伊朗、阿富汗、土耳其等地。本属具有 3 个相近的种, 即女妖头
带芒草 ( Ta. caput-medusae L . Nevski)、长发带芒草 ( Ta. crinitum Schreber Nevski) 和糙稃带
芒草 ( Ta. asperum Simonkai Nevski), 均为二倍体。目前尚未见报道其是否具有高分子量谷蛋
白, 如果有, 它们是否与普通小麦中发现的高分子量谷蛋白基因具有类似和相近的功能 ?
在本研究中, 我们对长发带芒草种高分子量谷蛋白亚基进行了检测和鉴定, 以期为认
识和利用带芒草属物种中的高分子量谷蛋白提供理论基础。
1 材料与方法
带芒草属 ( Taeniatherum Nevski) 长发带芒草 ( Ta. crinitum Schreber Nevski) 种的 3份材料被用于高分
子量谷蛋白亚基检测与鉴定。以普通小麦品种川育12 (高分子量谷蛋白亚基组成 1, 7+ 8, 5+ 10) 和中
国春 (高分子量谷蛋白亚基组成7+ 8, 2+12) 作为对照。
取半粒种子磨碎成细粉后加入 250μl 提取液。提取液的组成为: 0.0625 mmol L Tris-HCl pH 6.8, 2%
(V V) SDS, 10% (V V) glycerol, 2% (V V)β-mercaptoethanol 和 0.002% (V V) bromophenol blue 其间混匀
几次。10 000 r min离心5 min, 取上清用于 SDS-PAGE 分析。电泳在Bio-Rad mini-protean3 cell 仪器上进行,
胶浓度为 10% , 恒流 20 mA 直至溴酚蓝迁移出凝胶 30 min后停止电泳。用 1% coomsssieTM brilliant blue R-
250染色, 数码相机记录结果。
用于 PCR分析鉴定的引物序列为
P1: 5-ATGGCTAAGCGGC TTA GGTCCTCTTTG-3
P2: 5-CTATCACTGGCTA GGCCGACAATGCG-3
PCR扩增、产物回收及克隆参见我们以前的方法 (Yan 等, 2002) 进行。序列比较与分析采用 NCBI
网址的Blast分析。
2 结果与分析
2.1 SDS-PAGE
在 3 份带芒草材料中均检测到高分子量谷蛋白亚基 (图 1)。由于在此前没有对该物
种高分子量谷蛋白亚基的报道, 为了说明其蛋白亚基的特征, 我们引入了 2 份普通小麦材
料中国春和川育 12 作为参照系, 发现 3 份材料中均检测到比普通小麦中国春和川育 12 的
Dx2 和 Ax1 迁移率更慢或接近的蛋白带 (图 1, 无尾箭头所示) 应为其中的 x 型亚基。在
参照系普通小麦迁移率最快亚基 Dy10 和 Dy12 的下方, 各检测到染色强度与高分子量谷蛋
白亚基相当的带纹 (图 1, 有尾箭头所示) , 可能为其中的 y 型亚基, 但因其位于普通小
麦高分子量谷蛋白亚基的下方, 也不能排除其不是高分子量谷蛋白亚基。
2.2 PCR 鉴定
6 期 颜泽洪等: 应用 SDS-PAGE 分析和 PCR 鉴定长发带芒草的高分子量谷蛋白亚基 6 55
利用其中 1 份材料 PI204577 的总 DNA为模板进行 PCR 扩增试验。利用扩增编码区的
引物所得到的产物大小分别为 2.2 kb 和 1.7 kb 左右 (图 2) , 分别对应于其中的 x 和 y 亚
基。分别克隆到 T 载体中以测定其 N和 C 保守端序列。
图 1 带芒草物种高分子量谷蛋白亚基 SDS-PAGE
检测结果 1 . 川育 12; 2 . PI561094;
3 . PI2045776; 4 . PI205590; 5 . 中国春
图 2 PCR 扩增 PI204577 的高分子量谷蛋白亚基
Fig . 1 SDS-PAGE analysis of high molecular weight
Fig . 2 PCR amplification of HMW glutenin coding
glutenin subunits in Taeniatherum
sequences from Ta. crinitum accession PI204577
2.3 测序验证
分别利用 T载体上的 M13F 和 M13R 通用引物测定了阳性质粒的 N 端 DNA 序列, 经过
三联体密码翻译的氨基酸序列与普通小麦高分子量谷蛋白亚基的 N 保守端氨基酸序列类
似 (图 3), 这证实了带芒草物种中存在高分子量谷蛋白。对 y 亚基进行的全序列测定和
表达分析 (另文报道) 进一步证实了在长发带芒草中存在比普通小麦迁移率最快的 y 亚基
迁移率更快的可正常表达的亚基。
图 3 带芒草 x 和 y型亚基与小麦亚基的 N 端氨基酸序列比较
Fig . 3 Comparison of x and y type HMW glutenin in Taeniatherum with those of wheat in terms of N-terminal amino residues
3 讨论
在本研究中, 通过 SDS-PAGE 方法, 我们证实了带芒草物种具有高分子量谷蛋白亚
基, 其 x 型亚基的迁移率与普通小麦 Dx2 亚基接近或更慢, y 型亚基的迁移率比普通小麦
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Dy12 亚基的迁移率更快。通过序列测定与表达分析进一步证实了在带芒草物种中存在比
小麦 y 亚基更小的可表达的 y 型亚基。这说明作为牧草的带芒草物种具有和普通小麦类似
的高分子量谷蛋白。
在小麦和山羊草属等物种中以 PCR 的方法克隆新的高分子量谷蛋白基因的分子克隆技术
体系已经建立并取得成功 (Yan 等, 2002), 以高分子量谷蛋白基因作为转基因来源的表达载体
的构建以及技术体系的建立 (Francisco 等, 1997; Fredy 等, 1996), 为认识和利用这些小麦近缘
物种中所具有的新型蛋白亚基的功能提供了可能。因此, 有必要借助以上手段研究带芒草物种
中所具有的未知高分子量谷蛋白亚基, 以认识将其用于改良普通小麦加工品质的可能性。
〔参 考 文 献〕
Francisco B, Leonie R, Frank B, et al, 1997 . Transformation ofwheat with high molecular weight subunit genes results in improved
functional properties [J] . Nature Biotechnology, 15: 1295—1299
Fredy A, Vimla V, VibhaS, et al, 1996 . Integration and expressionof the high-molecular-weight glutenin subunit 1 Ax1 gene into
wheat [J] . Nature Biotechnology, 14: 1155—1159
Lawrence GJ, Shepherd KW, 1981 . Chromosomal location of genes controlling seed proteins in species related to wheat [J] . Theor #
Appl Genetics, 59: 25—31
Payne PI, Law CN, Nudd EE, 1980 . Control by homoloeologous group1 chromosomes ofthe high-molecular-weight subunits of glute- "
nin, a major protein of wheat endosperm [J] . Theor Appl Genetics, 58: 113—120
Payne PI, Holt LM, WorlandAJ, et al, 1982 . Structural and genetical studies on the high-molecular-weight subunits of wheat glute- "
nin III . Telocentric mapping of the subunit genes on the long arms of the homoeologous group1 chromosomes [J] . Theor Appl Ge-
netics, 63: 129—138
Peter SR, Arthur ST, Francisco B, et al, 1995 . Biotechnologyof Breed-making: unraveling and manipulating the multi-proteinglu-
tenin complex [J] . Nature Biotechnology, 13: 1185—1190
Yan ZH, Wan YF, Liu KF, et al, 2002 . Identification of a novel HMW glutenin subunit and comparison of its amino acid sequence %
with those of homologous subunits [J] . Chin Sci Bull, 47 (3): 220—225
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