Characterization of CFTR nonsense mutations using novel CFTR minigenes

79 Pages·2013·2.03 MB·English

by  João Amorim

UNIVERSIDADE DE LISBOA

FACULDADE DE CIÊNCIAS
DEPARTAMENTO DE QUÍMICA E BIOQUÍMICA

Characterization of CFTR nonsense mutations
using novel CFTR minigenes
João Pedro Pacheco Conde de Amorim
DISSERTAÇÃO
MESTRADO EM BIOQUÍMICA
Especialização em Bioquímica Médica

2013
UNIVERSIDADE DE LISBOA

FACULDADE DE CIÊNCIAS
DEPARTAMENTO DE QUÍMICA E BIOQUÍMICA

Characterization of CFTR nonsense mutations
using novel CFTR minigenes
João Pedro Pacheco Conde de Amorim
DISSERTAÇÃO
MESTRADO EM BIOQUÍMICA
Especialização em Bioquímica Médica
Orientadores: Doutora Anabela S. Ramalho
Professora Doutora Margarida D. Amaral
2013
Index

I Agradecimentos ...................................................................................................................................................................................... 5
II Resumo ....................................................................................................................................................................................................... 7
III Abstract ...................................................................................................................................................................................................... 9
IV Abbreviations ........................................................................................................................................................................................10
V Notes ..........................................................................................................................................................................................................13
1 Introduction ...........................................................................................................................................................................................14
1.1 Cystic Fibrosis – Overview ..............................................................................................................................................................14
1.2 Clinical Features of Cystic Fibrosis ..............................................................................................................................................15
1.3 CFTR structure and function ..........................................................................................................................................................16
1.4 Classification of CFTR mutations .................................................................................................................................................18
1.4.1- Class I – Mutations that lead to no protein production ........................................................................................................19
1.4.2- Class II – Mutants that prevent intracellular traffic ...............................................................................................................19
1.4.3- Class III - Mutations affecting the regulation of the chloride channel ..........................................................................19
1.4.4- Class IV - Mutations that lead to defective chloride transport .........................................................................................20
1.4.5 – Class V – Mutations that lead reduced levels of protein ................................................................................................20
1.4.6– Class VI – Reduced stability or altered regulation of separate ion channels ............................................................20
1.5 Current and upcoming Cystic Fibrosis treatments ..............................................................................................................20
1.6 Nonsense-mediated mRNA decay and CF nonsense mutations ....................................................................................22
1.7 PTC-containing transcripts resistant to NMD ........................................................................................................................24
1.9 Premature termination codon read-through .........................................................................................................................25
2 Objectives ................................................................................................................................................................................................27
3 Materials and Methods ......................................................................................................................................................................28
3.1 Production of vectors to study the susceptibility of CFTR mutant transcripts to NMD ....................................28
3.1.1 Bacterial strain ......................................................................................................................................................................................28
3.1.2 Plasmid vectors .....................................................................................................................................................................................28
3.1.3 Production of competent bacteria ...............................................................................................................................................29
3.1.4 Transformation of competent bacteria .....................................................................................................................................29
3.1.5 DNA extraction and quantification ..............................................................................................................................................30
3.1.6 Cloning-out .............................................................................................................................................................................................31
3
3.1.7 Site-directed Mutagenesis ...............................................................................................................................................................31
3.1.8 DNA sequencing ...................................................................................................................................................................................32
3.2 Production of transient and stable cell lines ..................................................................................................................................33
3.2.1 Characterization, culture and maintenance of cell lines ...................................................................................................33
3.2.2 Transient transfections .....................................................................................................................................................................34
3.2.3 Flp-In system for the establishment of stable cell lines ....................................................................................................34
3.3 RT-PCR analysis of CFTR PTC-containing transcripts .......................................................................................................36
3.3.1 RNA extraction ......................................................................................................................................................................................36
3.3.2 cDNA synthesis .....................................................................................................................................................................................38
3.3.3 Polymerase chain reaction ..............................................................................................................................................................37
3.3.3.1 Semi-quantitative analysis ..........................................................................................................................................................40
3.4 Biochemical and functional characterization of CFTR nonsense variants ...............................................................38
3.4.1 Preparation of total protein extracts ..........................................................................................................................................38
3.4.2 Western blot ...........................................................................................................................................................................................40
3.4.3 Immunofluorescence .........................................................................................................................................................................39
3.4.4 Iodide Efflux ...........................................................................................................................................................................................40
3.5 Pharmacological treatments ..........................................................................................................................................................41
3.5.1 Pharmacological indirect inhibition of Nonsense-mediated mRNA decay ..............................................................41
3.5.2 Pharmacological induction of PTC read-through .................................................................................................................41
4 Results .......................................................................................................................................................................................................42
4.1 Production of plasmid vectors ......................................................................................................................................................42
4.2 Evaluation of the effects of nonsense mutations on CFTR expression ......................................................................45
4.3 Assessment of NMD susceptibility of CFTR nonsense mutants ....................................................................................48
4.4 Assessment of intracellular localization and function of CFTR nonsense mutants .............................................51
4.5 PTC read-through and NMD inhibition in CFTR nonsense mutants by chemical compounds .......................54
5 Discussion ................................................................................................................................................................................................55
6 Final remarks and future perspectives .....................................................................................................................................60
7 Bibliography ...........................................................................................................................................................................................62
8 Appendices ..............................................................................................................................................................................................70
Appendix I – pcDNA5/FRT plasmid map .................................................................................................................................................70
Appendix II – pOG44 plasmid map .............................................................................................................................................................71
Appendix III – CFTR polypeptide and cDNA sequence......................................................................................................................72
4
I Agradecimentos
Gostaria de aproveitar este espaço, para a todos aqueles que de alguma forma
contribuíram para a sua realização, e que me apoiaram ao longo deste último ano.
Agradeço em primeiro às minhas orientadoras, à Doutora Anabela S. Rama-
lho por me ter aceitado no seu projeto, por toda a sua ajuda, disponibilidade e con-
fiança, que foram essenciais para o desenvolvimento deste trabalho, e por estar sem-
pre pronta a discutir atá as ideias mais absurdas. À Professora Margarida Amaral,
agradeço a forma como me acolheu no seu grupo, e por providenciar um ambiente
de trabalho altamente estimulante que sempre nos desafia a trabalhar e a pensar
melhor, e a encarar os erros e tentativas falhadas como oportunidades que de al-
guma forma podem ser aproveitadas.
Agradeço a todos os meus colegas de laboratório, que muitas vezes foram
bem mais que isso, por toda ajuda, até nos momentos mais difíceis, e por fazerem
com que o meu dia-a-dia nunca se tornasse rotineiro. Um enorme obrigado à Veró-
nica, a quem devo muito do que aprendi e por sempre me dizer aquilo que precisava
de ouvir, quer eu quisesse quer não. Agradeço à Sara Canato pela sua boa disposição
e por nunca levar a mal nenhuma das minhas piadas, mesmo aquelas de gosto mais
duvidoso, à Susana “Suz&Tina” Igreja e à sua cadela Lola por nunca deixarem que os
meus dias se tornassem entediantes, à Ana Marta “Chica Bacana” Romão toda a
ajuda nos stainnings, e por me apresentar a todo o universo de vídeos recônditos do
Youtube, e por introduzir todo um novo padrão do que é a indumentária própria
para o local de trabalho. À Ana Cachaço agradeço todas as lições de vida que retirei
dos seus eloquentes monólogos e ainda toda ajuda em todo o trabalho de micrósco-
pia. Agradeço ainda ao Prof. Carlos, à Marta, ao José, à Sara Afonso, Ines, Inna,
Onófrio e Nikhil por todo o apoio.
Agradeço aos meus três mosqueteiros, Cátia, Carlos e Sid, por estarem sem-
pre comigo nos bons e nos maus momentos durante o meu percurso nesta faculdade,
com quem cresci e aprendi imenso, com quem sei que posso sempre contar para
julgar os meus comportamentos mais infames.
Agradeço ainda aos meus amigos de longa data, Carlos e Graciano e por esta-
rem sempre disponíveis quando preciso mesmo quando não lhes digo nada durante
5
meses, e à minha grande amiga Tânia, que mesmo do outro lado do Oceano Atlântico
não se importa de me ouvir reclamar sobre tudo e mais alguma coisa e por encontrar
sempre uma forma de me pôr a sorrir.
Por fim gostaria de agradecer à minha família. À minha tia Guida, ao meu tio
Lico e ao Lima por se preocuparem sempre comigo por em várias instâncias terem-
me dado o apoio necessário para concluir este trajeto. Ao meu primo Francisco, por
ser um autêntico irmão, com quem posso contar para tudo. E especialmente aos
meus Avós, Luís e Isabel, que me criaram e educaram melhor do que se fossem meus
pais, que fizeram todos os esforços e sacrifícios possíveis e imagináveis para que eu
pudesse fazer sempre aquilo que ambicionava, e a quem devo tudo o que sou hoje.
6
II Resumo
A Fibrose Quística (FQ) é a doença recessiva autossómica letal mais comum
na população caucasiana e apresenta, na Europa, uma taxa de incidência de 1 em
3500 recém nascidos, enquanto que em Portugal, 1 em cada 6000 novos nados-vivos
apresenta a doença. A doença é causada por mutações no gene CFTR (do inglês Cystic
Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator) que levam à formação de uma pro-
teína (com o mesmo nome) com função anormal ou reduzida ou até à completa ini-
bição da expressão da mesma). A CFTR exerce a sua função de canal de cloreto e de
outros aniões na membrana apical de células epiteliais de vários tecidos.
Do ponto de vista clínico, a FQ é caracterizada por um rápido declínio da fun-
ção pulmonar devido à obstrução das vias respiratórias causada por infeções bacte-
rianas recorrentes e persistentes. Devido ao ambiente hiper-inflamatório provo-
cado por estas infeções, a remodelação do tecido pulmonar ocorre a um ritmo au-
mentado, que culmina na formação de fibrose no tecido e na consequente perda de
função. Este fenótipo pulmonar é o principal responsável pela morbilidade e morta-
lidade dos doentes com FQ. Para além do tecido pulmonar, outros órgãos e tecidos
são igualmente afetados, sendo que os pacientes apresentam frequentemente pro-
blemas digestivos graves e são geralmente inférteis (todos os homens e uma grande
percentagem das mulheres).
Até à data, foram identificadas mais 1900 alterações no gene CFTR sendo a
maioria causadora de doença, sendo a deleção do resíduo de fenilalanina na posição
508 da cadeia peptídica a mais comum das detetadas em pacientes e portadores
(~90% de todos os casos). Mutações nonsense levam, na maioria dos casos, à degra-
dação total ou quase total dos transcritos de CFTR, ao desencadearem o mecanismo
de degradação do mRNA denominado NMD (do inglês Nonsense-Mediated mRNA De-
cay).
Estudos recentes, realizados com gene que codifica para a β-globina, demons-
traram que a presença de codões stop prematuros em proximidade com o codão de
início da tradução não desencadeiam a degradação dos transcritos uma vez que não
levam à ativação de NMD. No entanto persiste a dúvida se tal sucederá em genes
bastante maiores como é o caso do gene CFTR.
7
O principal objetivo deste trabalho passou, portanto, por uma maior compre-
ensão do mecanismo de degradação NMD, no contexto de genes de grandes dimen-
sões, usando como modelo o gene CFTR. Mais concretamente, pretendeu-se carac-
terizar várias mutações nonsense, previamente detetadas em doentes com FQ e/ou
portadores, localizadas em proximidade com o codão AUG (Q2X, S4X e Q39X),
usando minigenes de CFTR gerados através de engenharia genética, bem como vali-
dar esse modelo para o estudo de NMD, ao induzir este mesmo mecanismo com a
mutação G542X, tal como haveria sido reportado em estudos prévios. Pretendeu-se
ainda testar capacidade de vários fármacos em induzir o read-through das várias
mutações nonsense.
Foram gerados vários plasmídeos codificando minigenes de CFTR, contendo
intrões normais e artificialmente construídos, com as várias mutações estudadas e
em seguida estabelecido um modelo de expressão estável e isogénica desses mes-
mos minigenes em células HEK 293.
Através de RT-PCR foi demonstrado que a presença da mutação G542X na
sequência do minigene de CFTR levou à ativação de NMD e consequente degradação
dos transcritos de CFTR, enquanto os transcritos dos variantes com mutações pró-
ximas do codão de iniciação não foram degradados.
Foi observada, a partir da análise por imunodeteção, a ocorrência da reinici-
ação da tradução da CFTR nos variantes resistentes à degradação por NMD, e que
proteína produzida, apesar de não possuir a região N-terminal era capaz de migrar
para a membrana celular. Ensaios de efluxo de iodeto indicaram que a proteína trun-
cada apresentava atividade reduzida e retardada.
Não foram no entanto bem-sucedidas as tentativas de promover através de
fármacos o read-through dos codões de stop prematuros em nenhum dos variantes.

Palavras-Chave: Fibrose Quística; CFTR; PTC; mutações nonsense próximas
de AUG; resistência a NMD.

8
III Abstract
Cystic Fibrosis is the most common lethal autosomic recessive disorder in the
Caucasian population, affecting 1 in 6000 newborns in Portugal, and is caused by
mutations in the CFTR gene which encodes for the CFTR protein.
Since its recognition, more than 1900 CFTR mutations have been identified,
being the deletion of a phenylalanine at position 508 the most prevalent of all. Most
nonsense mutations lead to complete loss of protein expression due to transcript
quick degradation via NMD pathway. However recent studies of the β-globin gene
showed some nonsense variants with AUG-proximal PTCs are resistant to this deg-
radation mechanism.
The principle aims of this study were to generate and validate a CFTR
minigene model that could be used for the study of NMD in the context of CFTR, a
far larger gene than β-globin (~190kb vs ~4 kb), to characterize, using said model,
naturally occurring AUG-proximal CFTR nonsense mutations, and test the efficacy
several pharmacological read-through promoting agents.
CFTR plasmid minigenes containing normal and artificially constructed in-
trons as well as several naturally occurring nonsense mutations (Q2X, S4X, Q39X
and G542X) were generated and a model for stable and isogenic expression of these
minigenes in HEK 293 cells established.
By RT-PCR analysis we showed that the presence of the mutation G542X, was
at the minigene sequence was able to activate NMD, while CFTR transcripts with
AUG-proximal nonsense mutations were not degraded.
It was shown by western blot essays that AUG-proximal nonsense variants
expressed a truncated form of CFTR lacking the N-terminus region which probably
resulted from the occurrence of translation re-initiation. Residual levels of this trun-
cated form of CFTR were also detected at the cytoplasmic membrane and iodide ef-
flux essays indicated that it possessed reduced and delayed channel function.
However, attempts of pharmacologically promote PTC read-through in any
nonsense variant were deemed unsuccessful.

Keywords: Cystic Fibrosis; CFTR; PTC; AUG-Proximal; NMD resistance.
9
IV Abbreviations

ABC – ATP-binding cassette
ABCC7 - ATP-binding cassette sub-family C member 7
AFT – arginine-framed-tripeptide
ATP – adenosine triphosphate
BSA – bovine serum albumin
CaCC – calcium activated chloride channel
cAMP – cyclic adenosine monophosphate
cDNA – complementary DNA
CF – cystic fibrosis
CFBE41o-/CFBE – cystic fibrosis bronchial epithelial (cell line)
CFF – cystic fibrosis foundation
CFTR – cystic fibrosis transmembrane conductance regulator
CHX – cyclohexamide
DAPI – 4',6-diamidino-2-phenylindole
dsDNA – double stranded DNA
DMSO – dimethylsulfoxide
eIF - eukaryotic initiation factor
EJC – exon junction complex
EMEM – Eagle’s minimum essential medium
ENaC – epithelial sodium channel
ER – endoplasmic reticulum
eRF – eukaryotic release factors
ERQC – endoplasmic reticulum quality control
FBS – fetal bovine serum
FLP – flippase
FRT- flippase recombination target
GDP – guanosine diphosphate
GFP – green fluorescent protein
GTP – guanosine triphosphate
GTPase – guanosine triphosphate hydrolase
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