Cell adhesion and cell mechanics during zebrafish development

237 Pages·2010·13.18 MB·English

Cell adhesion and cell mechanics
during zebrafish development
DISSERTATION
vorgelegt von Dipl. Biol. Michael Krieg am 02.10.2009
zurErlangungdesakademischenGradesDr.rer.nat.
derFakult¨atfu¨rNaturwissenschaften
derTechnischenUniversit¨atDresden
Tagdermu¨ndlichenVerteidigung: 07.12.2009
Consultant 1 Consultant 2
Prof.Dr.DanielJ.Mu¨ller Prof.Dr.Carl-PhilippHeisenberg
Biotec/TU-Dresden MPI-CBGDresden

Consultant 1 Consultant 2
Prof. Dr. Daniel J. Mu¨ller Prof. Dr. Carl-Philipp Heisenberg
Department of Cellular Machines MPI-CBG Dresden
Biotec / TU-Dresden

... to my family ...
... my parents and my sisters ...

Wenn ich ein Problem l¨osen will, dann darf durch die L¨osung
kein Bestandteil des Problems verschwinden Albert Camus.

Contents
Preface 1
1 Motivation and Summary 3
2 Introduction 9
2.1 Zebrafish gastrulation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9
2.1.1 Time course of development . . . . . . . . . . . . . . . . . 9
2.1.2 Nodal signaling . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14
2.1.3 Germ layer formation and epithelial mesenchymal transition 15
2.2 Adhesion and mechanics in development . . . . . . . . . . . . . . 19
2.2.1 Mechanical forces during tissue formation . . . . . . . . . . 20
2.2.2 Shaping cells . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31
2.3 Cell adhesion molecules . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34
2.3.1 Integrins . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35
2.3.2 Cadherins . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36
2.4 Cell adhesion techniques . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42
2.4.1 Image-based techniques to characterize cell adhesion . . . . 43
2.4.2 Techniques to measure cell adhesion forces . . . . . . . . . 46
2.5 AFM – an all-in-one toolbox for cell mechanics . . . . . . . . . . . 51
2.5.1 Single cell adhesion force spectroscopy . . . . . . . . . . . 51
2.5.2 Single cell elastography . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 56
3 Experimental Section 63
3.1 Techniques . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 63
3.1.1 AFM and SCFS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 63
3.1.2 Cell elasticity . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 67
3.1.3 Fluorescence recovery after photobleaching . . . . . . . . . 70
3.2 Methods . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 71
3.2.1 mRNA preparation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 71
3.2.2 Single cell microinjection . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 73
3.2.3 Cell culture . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 74
3.2.4 Hanging drop experiments . . . . . . . . . . . . . . . . . . 75
3.2.5 In-vitro biotinylation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 76
3.2.6 Western blotting . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 78
3.2.7 The AFM setup . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 79
3.2.8 Adhesion measurements . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 79
3.2.9 Cell-cortex tension measurements . . . . . . . . . . . . . . 81
3.2.10 Tether extraction using AFM . . . . . . . . . . . . . . . . 84
3.2.11 FRAP Protocol . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 85
3.2.12 Non-covalent surface modifications . . . . . . . . . . . . . 86
3.2.13 Covalent surface modification . . . . . . . . . . . . . . . . 87
3.2.14 Statistical data processing . . . . . . . . . . . . . . . . . . 88
3.2.15 Single cell transplantations . . . . . . . . . . . . . . . . . 88
3.2.16 Laser scanning confocal microscopy . . . . . . . . . . . . . 89
3.2.17 Image processing . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 89
3.3 Materials . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 91
3.3.1 Cell culture . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 91
3.3.2 Western blotting . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 93
3.3.3 Atomic force microscopy . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 94
4 Cell sorting and surface mechanics 95
4.1 Introduction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 95
4.2 Results and Discussion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 96
4.2.1 Adhesion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 96
4.2.2 Cortex Tension . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 101
4.2.3 Cell sorting . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 103
5 Cell cohesion and migration 119
5.1 Introduction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 119
5.2 Results and Discussion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 120
5.2.1 Collective cell migration . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 120
5.2.2 Migration in crowded and abandoned environment . . . . . 122
5.2.3 Modulation of cell adhesion properties . . . . . . . . . . . 123
5.2.4 Cell migration and cell-cell adhesion . . . . . . . . . . . . . 125
5.2.5 Summary of adhesion force measurements . . . . . . . . . 130