Caractérisation fonctionnelle de MtPM25, une protéine LEA (Late Embryogenesis Abundant), et

256 Pages·2017·7.18 MB·French

by  Virginie Boucher

Caractérisation fonctionnelle de MtPM25, une protéine
LEA ( Late Embryogenesis Abundant ), et implication
dans la qualité germinative des graines de Medicago
truncatula
Virginie Boucher
To cite this version:
Virginie Boucher. Caractérisation fonctionnelle de MtPM25, une protéine LEA ( Late Embryogenesis
Abundant ), et implication dans la qualité germinative des graines de Medicago truncatula. Biochimie
[q-bio.BM]. Université d’Angers, 2009. Français. ￿NNT: ￿. ￿tel-00476720￿
HAL Id: tel-00476720
https://theses.hal.science/tel-00476720
Submitted on 27 Apr 2010
HAL is a multi-disciplinary open access L’archive ouverte pluridisciplinaire HAL, est
archive for the deposit and dissemination of sci- destinée au dépôt et à la diffusion de documents
entific research documents, whether they are pub- scientifiques de niveau recherche, publiés ou non,
lished or not. The documents may come from émanant des établissements d’enseignement et de
teaching and research institutions in France or recherche français ou étrangers, des laboratoires
abroad, or from public or private research centers. publics ou privés.
UNIVERSITE D'ANGERS Année : 2009
UFR SCIENCES N° d'enregistrement : 1018
CARACTERISATION FONCTIONNELLE DE MtPM25, UNE PROTEINE
LEA (Late Embryogenesis Abundant), ET IMPLICATION DANS LA
MEDICAGO TRUNCATULA
QUALITE GERMINATIVE DES GRAINES DE
THESE DE DOCTORAT
Pour obtenir le grade de docteur de l'université d'Angers
Discipline : Biologie Cellulaire et Moléculaire Végétale
ECOLE DOCTORALE D'ANGERS
Présentée et soutenue publiquement le 24 Novembre 2009, à Angers
par :
Virginie Boucher
Devant le jury ci-dessous :

James Dat Professeur, Université d'Angers Président
Françoise Corbineau Professeur, Université Pierre et Marie Curie, Paris Rapporteur
Thierry Chardot Directeur de recherche, INRA, AgroParisTech Rapporteur
Véronique Gruber Professeur, Université Denis Diderot, Paris Examinateur
Directeur de thèse : Olivier Leprince Professeur, Agrocampus Ouest
Thèse préparée au sein de l'UMR 1191, Physiologie Moléculaire des Semences
(Université d'Angers, Agrocampus Ouest, INRA), 16 Boulevard Lavoisier, 49045 Angers

UNIVERSITE D'ANGERS Année : 2009
UFR SCIENCES N° d'enregistrement : 1018
CARACTERISATION FONCTIONNELLE DE MtPM25, UNE PROTEINE
LEA (Late Embryogenesis Abundant), ET IMPLICATION DANS LA
MEDICAGO TRUNCATULA
QUALITE GERMINATIVE DES GRAINES DE
THESE DE DOCTORAT
Pour obtenir le grade de docteur de l'université d'Angers
Discipline : Biologie Cellulaire et Moléculaire Végétale
ECOLE DOCTORALE D'ANGERS
Présentée et soutenue publiquement le 24 Novembre 2009, à Angers
par :
Virginie Boucher
Devant le jury ci-dessous :

James Dat Professeur, Université d'Angers Président
Françoise Corbineau Professeur, Université Pierre et Marie Curie, Paris Rapporteur
Thierry Chardot Directeur de recherche, INRA, AgroParisTech Rapporteur
Véronique Gruber Professeur, Université Denis Diderot, Paris Examinateur
Directeur de thèse : Olivier Leprince Professeur, Agrocampus Ouest
Thèse préparée au sein de l'UMR 1191, Physiologie Moléculaire des Semences
(Université d'Angers, Agrocampus Ouest, INRA), 16 Boulevard Lavoisier, 49045 Angers

En premier lieu, merci à Françoise Corbineau, Yves Popineau, Véronique Gruber, et
James Dat pour avoir accepter d’évaluer ce travail.

Merci à O. Leprince de m’avoir accueilli au laboratoire et pour son encadrement au cours de ces
trois ans.
Merci à Julia pour ces précieux conseils scientifiques, et son aide pour certaines manipulations.
Merci également à Catherine pour son aide en biologie moléculaire et sa gentillesse.
Un grand merci à tous les membres du laboratoire qui ont permis de rendre ces trois ans agréables.
Pascale, la protéomique serait bien triste sans toi, Nicole P., merci pour l’aide apporté pour la
culture des monstroplantes, et surtout merci pour avoir trouver les mots de réconforts à un moment
où j’allais mal, je n’ai pas oublié. Merci Benoit, ô grand maître de la culture de Medicago pour ton
aide dans la maîtrise de la bête. Merci à Patrick pour les bons moments de rigolade, et surtout pour
le poisson d’avril, mes tiroirs en ont gardé des traces chipsesques. Merci à Edith pour sa bonne
humeur, son efficacité hors pair ;) attention je te surveille ! Merci à Nicole C, pour sa grande
disponibilité, sa gentillesse et son merveilleux listing de produit. Merci à Sylvie pour sa sympathie.
Merci à Françoise, David M, Béa, Abdel, Lydie pour les discussions scientifiques ou moins.
Merci à Carolyne pour ses anecdotes rigolotes, les chewing-gum, et non, je ne suis pas gothique !
Une pensée pour ceux de l’université et surtout pour Marie-Laure.
Merci à Cécile Mangavel et Denis Renard, là-bas, à Nantes, pour la découverte de techniques bien
sympathiques.

Enfin, parce qu’ils sont la cerise sur le gâteau, la lumière dans l’obscurité parfois très opaque de la
science (et oui !), je dirais même la banane dans le banana split (c’est dire !), je tiens tout
particulièrement à remercier,
au sein du labo :
William, PES, et oui, ton humour et tes connaissances aussi vastes que improbables vont me
manquer ! (ainsi que les anecdotes de ton enfance). Merci pour ton soutien les jours de smiley à
l’envers, merci de me faire rire, ne changes pas.
Céline… Très chère, très formidable et très inégalable impératrice du QTL et de la génétique en
général ;) Chère PEB, j’aurais tant à dire que toute la thèse n’y suffirait pas… Prends garde au
Pigeon killer qui sommeille en chacun de nous et surtout aux blob blobisant, terribles !!! Tu as
toujours été là quand j’en avais besoin, sur la banquise, dévorée par le pingouin zombiesque, j’ai
survécue en partie grâce à toi !!! A qui je vais raconter mes rêves maintenant et surtout qui va être
en mesure de les comprendre ? Vivement le labo de la funitude !
Michaela, PEA, continue de rêver de moutons électriques et de te trouver au sommet de la courbe
du bonheur, mais attention au four à micro ondes pervers Burtonien ! Merci pour ta gentillesse et ta
disponibilité.
Johann (lire Yohann, pour les non connaisseurs), merci pour toutes les blagues et pour toutes les
œuvres d’art qui embellissent notre bureau, et surtout merci d’être aussi ADORABLE !
Emilie, PET, merci pour ta gentillesse, tu es formidable, ne perds pas ça de vue, n’abandonnes
jamais, dans un an je serais là pour t’acclamer ;)
David L, attention aux plasmides vicieux et autres constructions infernales. Merci pour ta
sympathie et pour ton rire.
Sophie, chère PEF, quand je te disais que tu étais la meilleure ! J’avais encore raison ! Merci pour
tous les bons moments.
Adrien, alias PEL, bon courage et bienvenue à toi dans Dallas, ton univers impitoyable, ne te perds
pas sur le jeu de l’oie.
En dehors du labo :
Benoît, Ah ! Mon cher ami ! Ca y est le nécronomicon est achevé. Gniark ! Gniark ! Les portes
dimensionnelles ne vont pas tarder à laisser sortir l’immondice obscène et je la dominerais et
règnerais sur le monde !!!! Shub-Niggurath ! Merci de me comprendre là où les autres sont perdus.
Plus qu’un an et toi aussi tu émergeras des sables mouvants engendrés par les champignons
vénéneux… Courage donc ! Je n’oublierais pas de te dédier ma palme d’or !
Caroline, je n’ai pas été très disponible, mais je ne t’ai pas oublié, merci pour ton soutien sans faille
et pour ta gentillesse, merci pour les sorties parisiennes ressourçantes.
Marion, j’espère pouvoir un jour transformé ma grenouille… Merci pour tout.
Anne-Sophie, ouaw ! Que de chemin parcouru ! Encore une étape de franchie, mais quand est ce que
je rentre dans la vraie vie moi aussi ?

Je remercie aussi ceux sans qui cette thèse n’aurait pu se faire : Medicago, même si tes gousses
acérées mon bien des fois transpercées je te remercie pour toutes les jolies graines à qui j’ai pu faire
subir mille tourments pour me venger. E.coli, franchement tu n’as pas fait d’effort avec PM25,
mais bon, désolée pour les UV. Ma protéine PM25, même si tu restes encore un peu mystérieuse, tu
seras pour toujours ma LEA préférée. EM6, je ne t’oublie pas non plus, merci d’avoir été un témoin
si sympathique. Mes monstroplantes adorées, dommage qu’il est fallu tant de temps pour vous
obtenir. Par contre, je ne remercie pas Arabido qui n’a pas été capable d’avoir des insertions au bon
endroit.

Je remercie également bien fort ma famille, mes parents et ma grand-mère pour leur soutien tout au
long de ces années, pour leur compréhension et leur amour indéfectible, merci aussi à Briséis.
Et pour conclure, parce qu’il faut finir par le meilleur (?!?), Dimitri, je te remercie. Crois tu que
j’aurais fait mieux que Vincent ? En fait nous ne le saurons jamais car le temps passe, et même si le
souvenir reste comme tu aimes à l’écrire, il n’en garde pas moins l’amertume du mot fin, sans la
saveur du mot recommencement ce qui m’astreins à enfermer les mots qui me viennent. Alors je
citerais simplement Oscar Wilde puisque nous l’aimons tout deux : « Chacun de nous porte en lui le
ciel et l’enfer ». Je te remercie pour tout le ciel que tu m’as apporté ; plus que quiconque n’avait pu
et ne pourra jamais le faire. Merci aussi pour avoir relue ce manuscrit, merci pour tous tes
encouragements.

Merci à tout ceux que j’ai oublié, et il y en a forcément, mais on s’embrasse on n’oublie tout…
Ouais, spécial dédicace à William, ok, bon le répertoire n’est pas le même, mais on fait avec ce qu’on
a !
Sommaire
Liste des figures..............................................................................................................5
Liste des tableaux...........................................................................................................6
Liste des abréviations.....................................................................................................7

Introduction Bibliographique
...........................................................9
1. Développement de la graine............................................................................11
1.1 Acquisition de la tolérance à la dessiccation....................................................14
1.2. Longévité des graines.......................................................................................15
1.3 La dormance......................................................................................................18

2. La tolérance à la dessiccation........................................................................19
2.1 Généralités........................................................................................................20
2.2 Impact de la dessiccation sur la cellule...........................................................21
2.2.1 Impact sur les membranes...................................................................21
2.2.2 Impact sur les protéines.......................................................................21
2.2.3 Impact sur le métabolisme, et augmentation du stress oxydant........22
2.2.4 Impact sur l’ADN................................................................................23
2.3 Mécanismes impliqués dans la tolérance à la dessiccation...........................25
2.3.1 Les systèmes antioxydant....................................................................25
2.3.2 Les sucres non réducteurs..................................................................26
2.3.2.1 L’hypothèse de remplacement de l’eau..............................26
2.3.2.2 Formation de l’état vitreux.................................................27
2.3.3 Les protéines HSP (Heat Shock Protein)..........................................28

3. Les protéines LEA (Late Embryogenesis Abundant).................................31
3.1 Origine des protéines LEA............................................................................31
3.2 Caractéristiques et classification des protéines LEA....................................33
3.3 Le groupe 5.....................................................................................................35
3.3.1 Descriptions des membres du groupe 5..............................................37
3.3.2 Particularités du groupe 5..................................................................37
3.4 Caractéristiques physico-chimiques des protéines LEA...............................39
3.5 Localisation cellulaire des protéines LEA....................................................41
3.6 Régulation transcriptionnelle des protéines LEA........................................42
3.7 Implications des protéines LEA dans la tolérance aux stress abiotiques....42
3.7.1 Rôle fonctionnel des protéines LEA : approches de génétique inverse
.....................................................................................................................45
3.7.2 Rôle fonctionnel des protéines LEA : approches in vitro................47
3.7.2.1 Protection des protéines.....................................................47
3.7.2.2 Protection membranaire....................................................48
3.7.2.3 Séquestration d’ions..........................................................49
3.7.2.4 Implication des protéines LEA dans la formation des états vitreux
........................................................................................................51

4. Medicago truncatula, un bon modèle d’étude de la physiologie des légumineuses
..........................................................................................................................53

5. PM25 et origine de ce travail.......................................................................55
Thématique du laboratoire et objectifs de la thèse..........................................59

Partie 1 : PM25, une LEA atypique, spécifique de la graine et

localisée dans le noyau
........................................... ..63
INTRODUCTION............................................................................................65

RESULTATS.....................................................................................................67
1.1. PM25, une protéine hydrophobe largement désordonnée à l’état natif et stable à
la chaleur.......................................................................................................................67
1.1.1 Détermination de l’hydrophobicité de PM25..................................................67
1.1.2 PM25, une protéine majoritairement non structurée en solution..................69
1.1.3 PM25 est stable à la chaleur dans une solution complexe de protéines........75
1.2 Etude de l’expression de PM25 au cours de la germination et de la croissance
post-germinative en conditions optimales et pénalisantes....................................77
1.2.1 Expression de PM25 au cours de l’imbibition.................................................77
1.2.2 Expression de PM25 en conditions osmotiques pénalisantes..........................79

1.3 Localisation cellulaire et tissulaire de PM25..................................................81
1.3.1 Localisation cellulaire de PM25........................................................................81
1.3.2 Localisation tissulaire de PM25........................................................................83

DISCUSSION.......................................................................................................85

Partie 2 : Caractérisation fonctionnelle de PM25

..................................................................................................................................89
INTRODUCTION.................................................................................................91

RESULTATS..........................................................................................................95
2.1 Effet de PM25 sur la protection de l’ADN et la survie bactérienne lors de stress
..................................................................................................................................95
2.1.1 Effet de PM25 sur la conformation de l’ADN..................................................95
2.1.2 Protection contre les UV.....................................................................................95
2.1.3 Protection contre la dessiccation.......................................................................97

2.2 Effet de PM25 sur la protection enzymatique.................................................99
2.2.1 Tests de protection de la citrate synthase..........................................................99
2.2.1.1 Effet de PM25 sur la protection de la citrate synthase pendant le
chauffage............................................................................................................103
2.2.1.2 Effet de PM25 sur la protection de la citrate synthase pendant le séchage
..............................................................................................................................105
2.2.2 Tests de protection de la lactate déshydrogénase...............................................105
2.2.2.1 Effet de PM25 sur la protection de la lactate déshydrogénase pendant la
congélation...........................................................................................................105
2.2.2.2 Effet de PM25 sur la protection de la lactate déshydrogénase pendant le
séchage.................................................................................................................105
2.3 Effet de PM25 sur la prévention de l’agrégation protéique...........................107
2.3.1 Effet de PM25 sur l’agrégation engendrée par la congélation........................109

2.4 Effet de PM25 sur la dissolution des agrégats...............................................111
2.4.1 Effet de PM25 sur la dissolution des agrégats après congélation...................111
2.4.2 Effet de PM25 sur la dissolution d’agrégats après des cycles de congélation
multiples......................................................................................................................113
2.4.3 Effet de PM25 sur l’agrégation engendrée par le séchage............................113
2.4.4 Effet de PM25 sur l’agrégation engendrée par une dialyse à différents pH :
mesure spectrophotométrique.................................................................................. .115
2.4.5 Effet de PM25 sur la protection de la citrate synthase après le chauffage...115
2.4.6 Effet de PM25 sur la protection de la lactate déshydrogénase après la congélation
.....................................................................................................................................119

2.5 Mesure et visualisation des agrégats..............................................................121

DISCUSSION.......................................................................................................123

Partie 3: Analyses physiologiques de mutants d’insertion tnt1 de
M.truncatula pour le gène PM25
..............................129
INTRODUCTION.................................................................................................131

RESULTATS.................................................................................................... .....135
3.1 Vérification des mutations et sélection de lignées homozygotes.....................135

3.2 Phénotypage physiologique des mutants pm25................................................137
3.2.1 Effet de PM25 sur la tolérance à la dessiccation...............................................137
3.2.2 Effet de PM25 sur la dormance..........................................................................139
3.2.3 Impact de PM25 au cours du vieillissement accéléré........................................143
3.2.4 Implication de PM25 dans la tolérance aux stress osmotique et salins............145
3.2.5 Impact de l’absence de PM25 sur la masse des graines.....................................145

3.3 Phénotypage biochimique..................................................................................147
3.3.1 Mesure des teneurs en eau...................................................................................147
3.3.2 Teneur en protéines de réserves...........................................................................149
3.3.3 Teneur en sucres solubles....................................................................................149
3.4 Etude de l’expression des homologues de PM25 au cours de la maturation et de
la germination en conditions optimales et pénalisantes..........................................155
3.4.1 Expression des homologues de PM25 au cours de la maturation......................155
3.4.2 Expression des homologues de PM25 au cours de la germination....................159
3.4.3 Expression des homologues de PM25 au cours de stress osmotique et salins...159

DISCUSSION.........................................................................................................163