Table Of ContentУспехи биологической химии, т. 45, 2005, с. 235—268
Са(cid:3)АТРаза САРКОПЛАЗМАТИЧЕСКОГО
РЕТИКУЛУМА: МОЛЕКУЛЯРНАЯ
ОРГАНИЗАЦИЯ, МЕХАНИЗМ
ФУНКЦИОНИРОВАНИЯ И
ОСОБЕННОСТИ РЕГУЛЯЦИИ
АКТИВНОСТИ
А. М. РУБЦОВ
8 2005 г.
Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова,
Москва
I. Введение. II. Мембранные препараты саркоплазматического
ретикулума. III. Структура молекулы Са(cid:23)АТРазы. IV. Реакцион(cid:23)
ный цикл Са(cid:23)АТРазы. V. Конформационная подвижность моле(cid:23)
кулы Са(cid:23)АТРазы. VI. Особенности кинетики Са(cid:23)АТРазы. VII.Оли(cid:23)
гомерная организация Са(cid:23)АТРазы. VIII. Регуляция активности
Са(cid:23)АТРазы. IX. Заключение.
I. ВВЕДЕНИЕ
Еще 15–20 лет назад можно было составить список клеток, основ(cid:23)
ные функции которых регулируются изменением уровня свободного
кальция в цитоплазме. В настоящее время можно сказать, что практи(cid:23)
чески во всех типах клеток наблюдаются периодические изменения кон(cid:23)
центрации цитоплазматического Са2+ – от 10–8–10–7 М до 10–6–10–5 М,
которые индуцируются различными физиологически активными
агентами и обеспечивают, регулируют или, по крайней мере, сопро(cid:23)
вождают проявление основных функций клеток данного типа.
Обычно эти изменения кратковременны, и после прекращения дей(cid:23)
ствия сигнала клетка быстро возвращается в состояние функциональ(cid:23)
ного покоя. Совершенно очевидно, что подавляющее большинство
Принятые сокращения: а.о. – аминокислотный остаток; СР – саркоплазма(cid:23)
тический ретикулум; ФЛ – фосфолипиды; AMPPCP – β, γ(cid:23)СН(cid:23)АТР; СаМ–
2
кальмодулин; FITC – флуоресцеинизотиоцианат; TG – тапсигаргин.
Адрес для корреспонденции: [email protected]
Работа поддержана грантом РФФИ 03(cid:23)04(cid:23)48661.
236 А.М.Рубцов Са(cid:30)АТРаза саркоплазматического ретикулума… 237
клеток имеет специальные системы, которые в покое поддерживают так называемый расслабляющий фактор Марша, способный разру(cid:23)
внутриклеточную концентрацию Са2+ на низком уровне и обеспечи(cid:23) шать актомиозиновый комплекс в экспериментах in vitro, удаляя из
вают его быстрое удаление после прекращения действия внешнего среды ионы Са2+, представляет собой не что иное, как фрагменты СР
сигнала (1), системы, которые в ответ на этот сигнал обеспечивают [2]. Предположение о присутствии в мембранах ретикулума каль(cid:23)
вход Са2+ в клетку из окружающей среды или его освобождение из циевого насоса, регулирующего концентрацию свободного кальция
внутриклеточных источников (2), а также системы, которые отвечают внутри мышечной клетки за счет энергии, выделяющейся в ходе гид(cid:23)
на изменение внутриклеточной концентрации Са2+ изменением своей ролиза АТР, вскоре получило экспериментальное подтверждение [3].
функциональной активности (3). Первые два типа систем представ(cid:23) Саркоплазматический ретикулум представляет собой замкнутую
лены мембранными белками – Са(cid:23)каналами и Са(cid:23)насосами, тогда систему сообщающихся друг с другом цистерн, пузырьков и трубочек,
как последняя подразумевает существование в цитоплазме специаль(cid:23) пронизывающих цитоплазму мышечной клетки в непосредственной
ных белков, которые при связывании Са2+ изменяют свою активность близости от миофибрилл. В ответ на деполяризацию сарколеммы,
и регулируют различные внутриклеточные процессы. В настоящее возникающую при проведении нервного импульса, в цитоплазму через
время такие системы хорошо известны, причем, несмотря на огром(cid:23) Са(cid:23)каналы (рианодиновые рецепторы) СР выходит Са2+, инициирую(cid:23)
ное разнообразие клеток и выполняемых ими функций, они доста(cid:23) щий образование актомиозинового комплекса, что приводит к
точно универсальны и имеют много общих свойств. мышечному сокращению [4]. Увеличение концентрации Са2+ в
Поддержание низкой концентрации Са2+ в цитоплазме большин(cid:23) цитоплазме, в свою очередь, активирует Са(cid:23)АТРазу, которая обеспе(cid:23)
ства типов клеток обеспечивается работой специальных мембран(cid:23) чивает аккумуляцию Са2+ во внутренних полостях ретикулума, в
ных ферментов – Са(cid:23)АТРаз или Са(cid:23)насосов плазматической мембра(cid:23) результате чего происходит снижение концентрации Са2+ в цито(cid:23)
ны и сарко(эндо)плазматического ретикулума, которые способны плазме, взаимодействие между актином и миозином блокируется и
переносить через мембрану 2 иона Са2+ против градиента его кон(cid:23) наступает расслабление мышцы [4, 5].
центрации за счет гидролиза 1 молекулы АТР. Особенностям органи(cid:23) Морфологически и функционально СР можно разделить на 2
зации, функционирования и регуляции Са(cid:23)АТРазы саркоплазмати(cid:23) отдела: продольные трубочки, окружающие миофибриллы, и терми(cid:23)
ческого ретикулума и посвящен настоящий обзор. нальные цистерны, находящиеся в тесном контакте с трубочками
Несмотря на то, что этот фермент был открыт в начале 60(cid:23)х годов Т(cid:23)системы, которые представляют
и интенсивно изучался в 70–90(cid:23)е годы ХХ века, он продолжает при(cid:23) собой впячивания cарколеммы
влекать внимание специалистов, так как Са(cid:23)АТРаза, благодаря срав(cid:23) (рис. 1). Терминальные цистерны
нительной простоте выделения, очистки и реконструкции, является СР и Т(cid:23)трубочки сарколеммы сое(cid:23)
очень удобным объектом для исследования молекулярных механиз(cid:23) динены между собой гидрофиль(cid:23)
мов функционирования и регуляции мембранных машин, исполь(cid:23) ным доменом молекулы Са(cid:23)ка(cid:23)
зующих освобождаемую при гидролизе АТР химическую энергию для нала (рианодинового рецептора)
переноса ионов через биологические мембраны, а также потому, что СР, который виден на электрон(cid:23)
разные изоформы Са(cid:23)АТРазы играют ключевую роль в обмене Са2+ ных микрофотографиях и получил
в большинстве клеток и тканей. название белка «соединительных
ножек» [6, 7].
Препараты СР получают из
II. МЕМБРАННЫЕ ПРЕПАРАТЫ
гомогенатов скелетных мышц ме(cid:23)
САРКОПЛАЗМАТИЧЕСКОГО РЕТИКУЛУМА
тодом дифференциального цент(cid:23)
Саркоплазматический ретикулум (СР) был обнаружен в мышеч(cid:23) рифугирования, проводя выде(cid:23)
ных клетках с помощью светового микроскопа и описан еще в XIX ление в изотоническом растворе
веке, а в конце 40(cid:23)х годов XX века его фрагменты были впервые выде(cid:23) NaCl или сахарозы и собирая фрак(cid:23) Рис. 1. Схема строения мышечного
лены Кейли и Мейергофом в процессе изучения АТРазной актив(cid:23) цию, осаждаемую между 20000 и волокна, иллюстрирующая располо(cid:23)
ности мышечной ткани [1]. Несколько позже было установлено, что 40000×g [8–10]. Полученные пре(cid:23) жение в клетке разных отделов СР.
238 А.М.Рубцов Са(cid:30)АТРаза саркоплазматического ретикулума… 239
параты представляют собой замкнутые везикулы диаметром 80–150 верхности мембран СР. Количество фосфатидилхолина по обе сто(cid:23)
мкм [11]. При дальнейшем центрифугировании в градиенте плотности роны мембраны примерно одинаково, а сфингомиелин находится,
сахарозы на основании их седиментационных свойств препарат СР главным образом, во внутреннем монослое мембран ретикулума [19].
можно разделить на 2 фракции – легкую и тяжелую. Легкая фракция
состоит, в основном, из фрагментов продольных трубочек, а тяжелая–
III. СТРУКТУРА МОЛЕКУЛЫ Са(cid:3)АТРазы
из фрагментов терминальных цистерн [6, 12]. Исследования белко(cid:23)
вого состава и процессов аккумуляции и выхода Са2+ из СР показали, Са(cid:23)АТРаза (АТР(cid:23)фосфогидролаза, ЕС 3.6.1.38) СР относится к
что разные отделы СР отвечают за разные этапы регуляции мышечного обширному семейству ион(cid:23)транспортирующих АТРаз Р(cid:23)типа (или
сокращения: терминальные цистерны обеспечивают выброс Са2+ в Е1–Е2(cid:23)типа), к которому принадлежат также Na,К(cid:23) и Са(cid:23)АТРазы
ходе мышечного сокращения и обогащены Са(cid:23)каналами СР (риано(cid:23) плазматических мембран, Н,К(cid:23)АТРаза слизистой желудка и ряд дру(cid:23)
диновыми рецепторами), а продольные трубочки осуществляют акку(cid:23) гих АТРаз, играющих важную роль в жизни клеток [20]. Эти фер(cid:23)
муляцию Са2+ на стадии расслабления и характеризуются высоким менты обеспечивают трансмембранный перенос катионов против их
содержанием Са(cid:23)АТРазы [4, 13]. электрохимического градиента за счет энергии, освобождающейся
Получаемые методом дифференциального центрифугирования при гидролизе АТР. В ходе реакционного цикла образуется промежу(cid:23)
препараты СР содержат липиды в соотношении ~0,5 мг/мг белка СР точный фосфорилированный интермедиат фермента (отсюда наз(cid:23)
[10, 12]. Около 80% липидной фракции представлено фосфолипи(cid:23) вание «АТРазы Р(cid:23)типа») вследствие переноса терминального фосфо(cid:23)
дами (ФЛ), нейтральные липиды представлены преимущественно три(cid:23) рильного остатка АТР на остаток аспарагиновой кислоты активного
глицеридами, а также холестерином. Из общего количества ФЛ 65– центра АТРазы [20, 21]. После фосфорилирования фермента его кон(cid:23)
73% составляет фосфатидилхолин, 12–19% — фосфатидилэтанол(cid:23) формация изменяется из состояния Е1 в Е2 (отсюда название «АТРазы
амин, ~4% — сфингомиелин и 0,1–0,3% — кардиолипин [10, 12]. Е1–Е2(cid:23)типа»), что сопровождается переносом ионов через мембрану.
Липиды мембран СР играют не только структурную, но и регулятор(cid:23) Са(cid:23)АТРаза сарко(эндо)плазматического ретикулума, или SERCA,
ную роль. Удаление ФЛ приводит к полной инактивации Са(cid:23)АТРазы, представлена в разных тканях млекопитающих несколькими изофор(cid:23)
а для восстановления её активности необходимо, чтобы с одной моле(cid:23) мами: SERCA1а (994 а.о.) и фетальная форма SERCA1b (1001 а.о.) – в
кулой фермента связалось около 30 молекул ФЛ [14]. Вместо фосфо(cid:23) быстрых скелетных мышцах, SERCA2а (997 а.о.) – в сердце, мед(cid:23)
липидов для реактивации фермента можно использовать и неионные ленных скелетных и гладких мышцах, SERCA2b (1042 а.о.) – во мно(cid:23)
детергенты, причем степень восстановления активности Са(cid:23)АТРазы гих типах клеток (так называемый «household» фермент) и SERCA3
зависит от величины коэффициента HLB (гидрофильно(cid:23)липофиль(cid:23) (999 а.о.) – в клетках крови и различных эндотелиальных и эпители(cid:23)
ного баланса) используемого детергента [15]. Изучение взаимодейст(cid:23) альных тканях [20].
вия между белком Са(cid:23)АТРазы и детергентами показало, что гидро(cid:23) Молекула Cа(cid:23)АТРазы CР скелетных мышц расположена в мемб(cid:23)
фильные группы детергентов непосредственно контактируют с поляр(cid:23) ране асимметрично: примерно 70% а.о. обращено в цитоплазму, 25%
ными аминокислотными остатками, которые находятся на границе находится в мембране и 5% обращено внутрь полостей СР [22]. Сог(cid:23)
между гидрофобными и гидрофильными доменами, что говорит о важ(cid:23) ласно данным рентгеноструктурного анализа SERCA1 с разрешением
ной роли гидрофильных полярных групп липидов в поддержании в 2,6 D [23], цитоплазматическая часть Са(cid:23)АТРазы состоит из трех
нативной структуры и активности фермента [16]. Кроме того, отри(cid:23) доменов: N(cid:23)домена (нуклеотидсвязывающего), Р(cid:23)домена (фосфори(cid:23)
цательно заряженные ФЛ (фосфатидилинозитол, фосфатидилсерин) лируемого) и активаторного (или «заякоривающего») домена А (рис.
активируют гидролиз АТР и аккумуляцию ионов Са2+ [17, 18]. 2). Центральную часть молекулы занимает Р(cid:23)домен, который содер(cid:23)
Фосфолипиды мембран СР асимметрично локализованы в бислое. жит фосфорилируемый в ходе реакционного цикла остаток Аsp351.
С использованием флуоресцентных меток было установлено, что Этот домен состоит из двух частей: N(cid:23)концевой (приблизительно между
70–80% фосфатидилэтаноламина расположено на внешней стороне Asp330 и Asp359), которая соединена с трансмембранной спиралью
мембраны и лишь 20–30% этого фосфолипида находится во внутрен(cid:23) М4, и С(cid:23)концевой (между Lys605 и Asp737), соединенной с транс(cid:23)
нем монослое мембраны, а фосфатидилсерин, недоступный для флуо(cid:23) мембранной спиралью М5. Эти две части Р(cid:23)домена, образованные
ресцентных меток, локализован преимущественно на внутренней по(cid:23) семью слоями параллельных β(cid:23)структур и восемью короткими спира(cid:23)
240 А.М.Рубцов Са(cid:30)АТРаза саркоплазматического ретикулума… 241
лями, формируют Россмановс(cid:23) зывающего центра. Это означает, что домены N и P должны прибли(cid:23)
кую складку. Фосфорилируемый зиться друг к другу во время гидролиза АТР. Действительно, ряд дан(cid:23)
остаток Asp351 находится в С(cid:23)кон(cid:23) ных указывает на то, что N(cid:23)домен в отсутствие Са2+ находится в
цевой части центральной β(cid:23)струк(cid:23) фиксированном состоянии, но становится подвижным в его присутст(cid:23)
туры. Интересно отметить, что вии и в результате конформационных изменений, которые индуциру(cid:23)
мутации Cys349, Lys352 и Thr353 ются связыванием АТР, N(cid:23)домен приближается к Р(cid:23)домену [25, 26].
не оказывают влияния на фос(cid:23) Подробнее конформационные переходы Са(cid:23)АТРазы будут рассмот(cid:23)
форилирование фермента. Это рены ниже.
говорит о том, что в непосредст(cid:23) Трансмембранная часть фермента (М) состоит из 10 α(cid:23)спиралей
венном окружении фосфорили(cid:23) (М1–М10). Cпирали М4, М5, М6 и М8 располагаются вокруг двух
руемого остатка аспарагиновой высокоплотных областей, которые были идентифицированы на осно(cid:23)
кислоты допустимы определен(cid:23) вании данных рентгеноструктурного анализа как ионы кальция (рис.
ные изменения [21, 24]. 2). Было установлено, что два участка связывания кальция находятся
Нуклеотидсвязывающий до(cid:23) в мембране на одном уровне на расстоянии 5,7 D друг от друга [23].
мен (N(cid:23)домен) – самый большой Первый участок связывания образуется за счет отрицательно заря(cid:23)
из трех цитоплазматических до(cid:23) женных боковых групп Asn768, Glu771 (M5), Thr799, Asp800 (M6) и
менов, имеет молекулярную мас(cid:23) Glu908 (M8). Второй участок связывания кальция сформирован осе(cid:23)
су около 27 кДа. Этот домен сфор(cid:23) выми карбонильными группами спирали М4: Val304, Ala305, Ile307 и
мирован остатками Gln360(cid:23)Arg604, боковыми кислородсодержащими группами: Asn796, Asp800 (M6) и
находящимися между двумя об(cid:23) Glu309 (M4). Таким образом, два участка связывания Са2+ фермента
Рис. 2. Структура молекулы Са(cid:23)АТРазы
ластями Р(cid:23)домена. Он образован в конформации Е1(cid:23)Са2+ находятся в непосредственной близости друг
по данным рентгеноструктурного ана(cid:23)
лиза [23]. семью полосами антипараллель(cid:23) от друга и образованы четырьмя спиралями (М4, М5, М6 и М8), две
α(cid:23)Спирали показаны в виде ци(cid:23) ных β(cid:23)структур и двумя спира(cid:23) из которых находятся в частично деспирализованном состоянии для
линдров, β(cid:23)складки – в виде плоских лями, которые объединяют эти β(cid:23) более эффективного связывания кальция [27, 28]. Данные рентгено(cid:23)
стрелок. Цвет молекулы фермента ме(cid:23)
структуры в образование, напо(cid:23) структурного анализа о длине и расположении трансмембранных
няется от синего (N(cid:23)конец) до красного
минающее сэндвич. Домен А спиралей молекулы Са(cid:23)АТРазы несколько расходятся с выводами,
(С(cid:23)конец). Заглавными латинскими
буквами А, N и Р обозначены гидро(cid:23) (также называемый β(cid:23)доменом)– сделанными на основе анализа первичной структуры молекулы фер(cid:23)
фильные домены (активаторный, нук(cid:23) самый маленький из трех цито(cid:23) мента [27]. Так, толщина гидрофобного домена молекулы Са(cid:23)АТРазы
леотидсвязывающий и фосфорилируе(cid:23) плазматических доменов, его мо(cid:23) меньше толщины фосфолипидного бислоя мембраны СР (примерно
мый, соответственно), буквой М – гид(cid:23)
лекулярная масса около 16 кДа. 30–32 D) и составляет около 21 D. Об этом говорит расстояние между
рофобный трансмембранный домен.
Он состоит примерно из 110 а.о., остатками триптофана в спиралях М4, М7, М9, М10 и Lys262, локали(cid:23)
Пронумерованы α(cid:23)спирали в доменах
А, М и Р. В N(cid:23)домене в виде атомной которые формируют неупорядо(cid:23) зованными на цитоплазматической поверхности мембраны СР, и
модели показана молекула связанного ченную структуру между транс(cid:23) остатком Lys972, который экспонирован во внутреннее пространство
АТР, а в гидрофобном домене – связан(cid:23) мембранными спиралями М2 и СР [27]. Таким образом, некоторые трансмембранные спирали
ные ионы Са2+ (в виде фиолетовых ша(cid:23)
М3, и 40 остатков N(cid:23)концевой Са(cid:23)АТРазы выступают из мембраны над ее цитоплазматической
риков за трансмембранной α(cid:23)спиралью
части фермента, которые форми(cid:23) поверхностью. В то же время, присутствие большого количества заря(cid:23)
М3). Стрелками показаны аминокис(cid:23)
лотные остатки, атакуемые трипсином руют две короткие спирали. Этот женных аминокислотных радикалов в трансмембранных спиралях
(Т, оранжевые стрелки), протеазой К домен связан с трансмембранной Са(cid:23)АТРазы на границе раздела липид/вода полностью подтверждает
(prtK, красные стрелки) и протеазой V8 областью длинными петлями [23]. высказываемые ранее предположения о важной роли электростати(cid:23)
(V8, желтые стрелки) [25]. Пунктирные
Участок фосфорилирования ческих взаимодействий полярных групп ФЛ с молекулой фермента в
стрелки показывают движение доменов
(Asp351) находится на расстоя(cid:23) стабилизации ее структуры [16–18].
N и А при конформационном переходе
Е1–Е2 (объяснения в тексте). нии около 25 D от нуклеотидсвя(cid:23)
242 А.М.Рубцов Са(cid:30)АТРаза саркоплазматического ретикулума… 243
IV. РЕАКЦИОННЫЙ ЦИКЛ Са(cid:3)АТРазы Гидролиз АТР Са(cid:23)АТРазой сопровождается переносом γ(cid:23)фосфо(cid:23)
рильного остатка от АТР на фермент с образованием кислотостабиль(cid:23)
Механизм функционирования Са(cid:23)АТРазы СР к настоящему вре(cid:23)
ной связи между фосфатом и остатком аспарагиновой кислоты [35].
мени довольно хорошо изучен и описан в ряде статей и обзоров [5, 21,
Фосфорилированный интермедиат Са(cid:23)АТРазы может находиться в
29–34]. Цикл работы Са(cid:23)АТРазы начинается с того, что фермент,
двух разных энергетических состояниях – ADP(cid:23)чувствительном и
находящийся в конформационном состоянии Е1, активируется за
ADP(cid:23)нечувствительном. Из кинетических данных следует, что после
счет последовательного связывания двух ионов Са2+ с цитоплазмати(cid:23)
фосфорилирования Са(cid:23)АТРазы ADP освобождается из фермента, а
ческой стороны мембраны и связывания АТР в нуклеотидсвязываю(cid:23)
фосфат и Mg2+ остаются связанными в его каталитическом центре
щем участке (рис. 3). Связывание двух ионов кальция происходит
[36]. Если к фосфоферменту в этих условиях добавить избыток ADP,
кооперативно с кажущейся К 2,3×10–6 М–1, а максимальное коли(cid:23)
с то происходит синтез АТР. Такую форму фосфофермента называют
чество кальция, которое может связаться с мембранными препара(cid:23)
ADP(cid:23)чувствительной. Фосфорилирование фермента в присутствии
тами фермента, составляет 8–10 нмоль Са2+ на 1 мг белка СР, что
Са2+ и АТР индуцирует конформационные изменения Са(cid:23)АТРазы, и
хорошо согласуется с содержанием белка Са(cid:23)АТРазы в мембранах
фермент переходит в состояние Е2.
ретикулума [10, 12]. Связывание Са2+ и АТР с ферментом может проис(cid:23)
Изомеризация фермента со связанным кальцием приводит сна(cid:23)
ходить в любой последовательности, но только после оккупации обоими
чала к окклюзии ионов кальция внутри молекулы фермента, то есть
лигандами соответствующих центров связывания фермент фосфори(cid:23)
они становятся недоступными для Са(cid:23)связывающих агентов или для
лируется.
обмена ни изнутри, ни снаружи везикул СР [37, 38], а затем к пере(cid:23)
носу кальция во внутренние полости ретикулума [39–41]. При кон(cid:23)
формационном переходе Е1–Е2 происходит превращение ADP(cid:23)чувст(cid:23)
вительного фосфорилированного интермедиата в ADP(cid:23)нечувстви(cid:23)
тельную форму. Добавление ADP к такой форме фосфофермента уже
не приводит к синтезу АТР. Вследствие конформационного перехода
фермента из состояния Е1 в Е2 резко снижается сродство Са(cid:23)АТРазы
к ионам Са2+, и они выходят во внутренние полости ретикулума, при
этом общая концентрация Са2+ внутри везикул СР может достигать
60–75 мМ [4]. Так как большая часть кальция связывается локализо(cid:23)
ванными внутри полостей ретикулума Са(cid:23)связывающими белками
кальсеквестрином [42, 43], кальретикулином [44, 45], саркалюмени(cid:23)
ном [46, 47] и богатым гистидином Са(cid:23)связывающим белком [48],
концентрация свободного Са2+ внутри СР составляет несколько мил(cid:23)
лимолей/литр, то есть градиент концентрации ионов Са2+ на мембране
СР составляет около 103 [10, 21, 33]. Цикл завершается изомеризацией
фермента из конформации Е2 в Е1 после Mg(cid:23)зависимого гидролиза
Рис. 3. Реакционный цикл Са(cid:23)АТФазы СР. фосфофермента с освобождением P в цитоплазму. При Е1(cid:23)Е2 переходе
Работа фермента начинается со связывания двух ионов Са2+ и молекулы в качестве противоионов Са(cid:23)АТРi аза переносит через мембрану
АТР с цитоплазматической стороны мембраны СР в соответствующих центрах протоны, однако стехиометрия этого переноса окончательно не
фермента, находящегося в конформации Е1 (ионы Са2+ и АТР связываются
установлена [33].
независимо друг от друга в любой последовательности, см. подробные объясне(cid:23)
Транспорт кальция является обратимым процессом. В присутст(cid:23)
ния в тексте). После гидролиза АТР, фосфорилирования Са(cid:23)АТРазы и освобож(cid:23)
дения АDP происходит основной конформационный переход фосфори(cid:23) вии в среде ADP и P и при высокой внутривезикулярной и низкой
i
лированного интермедиата фермента – из ADP(cid:23)чувствительной формы (СаЕ1Р) наружной концентрации ионов кальция может происходить обрат(cid:23)
2
в ADP(cid:23)нечувстввительную (CаЕ2Р). Ионы Са2+ освобождаются внутрь полостей ный перенос двух ионов кальция через мембрану СР, сопровождае(cid:23)
2
СР, после чего происходит Mg(cid:23)зависимый гидролиз фосфоинтермедиата и кон(cid:23) мый синтезом 1 молекулы АТР [49, 50]. Добавление Р к Са(cid:23)АТРазе в
формационный переход фермента из состояния Е2 в Е1. i
244 А.М.Рубцов Са(cid:30)АТРаза саркоплазматического ретикулума… 245
присутствии Mg2+ позволяет получить ADP(cid:23)нечувствительную форму V. КОНФОРМАЦИОННАЯ ПОДВИЖНОСТЬ
фосфорилированного интермедиата Е2–Р [49]. МОЛЕКУЛЫСа(cid:3)АТРазы
Следует отметить, что до настоящего времени широко дискути(cid:23)
Как было сказано выше, в ходе реакционного цикла Са(cid:23)АТРаза
руется вопрос о том, сколько участков связывания Са2+ содержит
СР, как и все остальные АТРазы Р(cid:23)типа, может находиться в двух
молекула Са(cid:23)АТРазы: два, сродство которых изменяется в ходе реак(cid:23)
основных конформационных состояниях – Е1 и Е2. Главное различие
ционного цикла, или четыре – два с высоким сродством к Са2+ (дос(cid:23)
между ними заключается в сродстве катионсвязывающих центров
тупны с цитоплазматической стороны мембраны) и два с низким срод(cid:23)
фермента к переносимым ионам и в доступности этих центров для
ством (доступны со стороны полостей ретикулума), при этом предпо(cid:23)
ионов с цитоплазматической или внеклеточной стороны мембраны (в
лагается, что конформационный переход молекулы фермента из
случае Са(cid:23)АТРазы – люминальной стороны мембраны ретикулума) [20].
состояния Е1 в Е2 сопровождается перемещением ионов Са2+ из одних
Однако уже в конце 70(cid:23)х годов прошлого века стало ясно, что число
участков в другие [31, 32, 51, 52]. Хотя данные рентгеноструктурного
возможных конформационных состояний молекулы Са(cid:23)АТРазы не
анализа указывают на присутствие в трансмембранном домене
ограничивается этими двумя основными конформациями, т. к. моле(cid:23)
молекулы фермента только двух связанных ионов Са2+ [23, 28], следует
кула фермента обладает значительной конформационной лабиль(cid:23)
заметить, что в данном случае Са(cid:23)АТРаза была зафиксирована в
ностью. Поскольку добавление субстратов фермента (или их анало(cid:23)
состоянии Е1(cid:23)Са2+, а точное расположение ионов металла в молекуле
гов) в разных сочетаниях, использование ингибиторов, в частности
фермента, находящейся в конформационном состоянии Е2–Са2+,
тапсигаргина, и варьирование значений рН среды позволяет зафик(cid:23)
пока не установлено. Детальный анализ освобождения Са(cid:23)АТР(cid:23)
сировать фермент преимущественно в одном из промежуточных сос(cid:23)
азой окклюдированного Са2+ в присутствии специфического ингиби(cid:23)
тояний, достаточно легко проанализировать конформацию его моле(cid:23)
тора фермента тапсигаргина подтверждает модель, согласно которой
кулы с помощью разных методов. Так, анализ модификации сульф(cid:23)
при работе фермента ионы Са2+ последовательно перемещаются из
гидрильных групп фермента тиоловым реагентом НБД(cid:23)хлоридом
центров с высоким сродством в центры с низким сродством через ок(cid:23)
позволил выявить значительные различия в количестве и кинетичес(cid:23)
клюдированное состояние, т.е. трансмембранный домен Са(cid:23)АТРазы
ких характеристиках доступных для этого агента SH(cid:23)групп в разных
формирует в мембране СР некое подобие ион(cid:23)проводящего канала
условиях: при фиксации Са(cid:23)АТРазы в состоянии Е1 (рН 7,0 в при(cid:23)
[52]. Кроме того, недавно было показано, что в мембранах СР фермент
сутствии ЭГТА), Е1–Са2+ (в присутствии микромолярных концент(cid:23)
присутствует в разных формах, которые отличаются сродством к Са2+
раций Са2+), Е1–АТР (в присутствии АТР, но в отсутствие двухва(cid:23)
и скоростью его связывания, причем на эти параметры существенное
лентных катионов), Е1–Р (в присутствии АТР и миллимолярных кон(cid:23)
влияние оказывает взаимодействие с Са(cid:23)АТРазой АТР и других нук(cid:23)
центраций Са2+, но в отсутствие Мg2+), хотя во всех этих условиях
леотидов [53, 54]. По всей видимости, эти формы Са(cid:23)АТРазы представ(cid:23)
фермент находился в основном конформационном состоянии Е1 [59].
ляют собой разные олигомерные комплексы фермента.
Поскольку такие различия в свойствах SH(cid:23)групп Са(cid:23)АТРазы были
Как упоминалось выше, реакционный цикл Са(cid:23)АТРазы полностью
обнаружены при использовании как нативных препаратов СР [59],
обратим. В ряде лабораторий были измерены константы скоростей
так и высокоочищенного фермента [60], можно было заключить, что
прямых и обратных реакций для большинства промежуточных стадий
наблюдаемые изменения кинетических характеристик SH(cid:23)групп
этого цикла [14, 30, 31, 49]. С использованием этих констант построе(cid:23)
отражают изменения конформации молекулы Са(cid:23)АТРазы, происхо(cid:23)
ны кинетические модели, которые удовлетворительно описывают
дящие в ходе реакционного цикла.
имеющиеся экспериментальные данные. Наиболее детально кинети(cid:23)
С использованием Са(cid:23)АТРазы, ковалентно модифицированной
ческие аспекты функционирования Са(cid:23)АТРазы в разных условиях
спин(cid:23)меченым производным N(cid:23)этилмалеимида, было обнаружено,
представлены в многочисленных публикациях, вышедших из лабора(cid:23)
что температурные зависимости сегментальной подвижности молеку(cid:23)
тории А. Ли [55–58]. Самыми «медленными» стадиями реакционного
лы фермента, находящегося в конформационных состояниях Е1–Са2+
цикла являются конформационные переходы из состояния Е1–Са2+
и Е1–АТР, значительно различаются и практически не зависят от тем(cid:23)
в состояние Е2–Са2+ и/или из состояния Е2 в состояние Е1, которые,
пературных перестроек липидов мембраны СР [61]. В то же время, сег(cid:23)
вероятно, и определяют общую скорость работы фермента.
ментальная подвижность молекулы фермента в состоянии Е1–Р четко
коррелирует с термоиндуцированными изменениями подвижности
липидов в мембране ретикулума [61].
246 А.М.Рубцов Са(cid:30)АТРаза саркоплазматического ретикулума… 247
Более определенная информация о конформации ряда промежу(cid:23)
точных интермедиатов Са(cid:23)АТРазы была получена в опытах с ограни(cid:23)
ченным протеолизом молекулы фермента трипсином и протеазами К
и V8 [25, 26]. Молекула фермента была зафиксирована в конфор(cid:23)
мационном состоянии Е1–Са (в присутствии Са2+), Са–Е1–АТР
(вприсутствии негидролизуемого аналога субстрата АМРРСР),
Са–Е1–Р–ADP (в присутствии АDP и AlF–), Са–Е1–Р (в присутст(cid:23)
вии AlF–, при этом переход фермента в состо4яние Е2–Р блокировался
4
высокими концентрациями Са2+ или обработкой N(cid:23)этилмалеимидом)
и Е2–Р (в присутствии Р или ванадата). Оказалось, что все эти кон(cid:23)
i
формации значительно отличаются друг от друга по доступности
участков, расщепляемых разными протеазами, за исключением участ(cid:23)
ка трипсинолиза Т1 (Lys505), который экспонирован на поверхности
N(cid:23)домена и доступен для расщепления во всех условиях (рис. 2). Так,
переход фермента из конформации Е1–Са2+ в Е1–АТР приводит к
резкому замедлению его расщепления протеазами К и V8, а переход в
конформации Е1–Р–АDP или Е1–Р – полностью блокирует действие
этих протеаз [26]. Во всех случаях также уменьшается доступность
участка трипсинолиза Т2 (Arg198), расположенного в А(cid:23)домене. В то
же время, молекула Са(cid:23)АТРазы в конформации Е2(cid:23)Р устойчива к
действию названных протеаз, за исключением участка трипсинолиза Рис. 4. Схематическая модель, иллюстрирующая взаимное движение гидро(cid:23)
Т1 [25]. На основе полученных данных было высказано предположе(cid:23) фильных доменов молекулы Са(cid:23)АТРазы в процессе работы фермента [26].
ние, что связывание лигандов с Са(cid:23)АТРазой в конформации Е1 и После связывания АТР в соответствующем центре (желтый овал) N(cid:23)домена
последующее фосфорилирование фермента приводит к значительной (красный) происходит сближение доменов N и А (синий) в направлении, пока(cid:23)
занном зелеными стрелками. Кроме того, А(cid:23)домен вращается вокруг оси, пер(cid:23)
взаимной переориентации его гидрофильных доменов, а переход фер(cid:23)
пендикулярной плоскости мембраны СР (показано стрелкой). Такое сближение
мента в конформацию Е2–Р сопровождается их сближением и форми(cid:23)
гидрофильных доменов приводит к Mg(cid:23)зависимому фосфорилированию остатка
рованием очень компактной структуры (рис. 4). Конформация гидро(cid:23) аспарагиновой кислоты (D351) в Р(cid:23)домене (коричневый). Далее фосфорилиро(cid:23)
фильного домена Са(cid:23)АТРазы в состоянии Е2 (зафиксирована с ванный интермедиат переходит из состояния СаЕ1Р в состояние Е2Р, что сопро(cid:23)
использованием тапсигаргина) менее компактна, чем в состоянии вождается освобождением Са2+ внутрь полостей СР и изменением конформа(cid:23)
Е2–Р, а переход в состояние Е1 сопровождается расхождением цито(cid:23) ции всей гидрофильной части молекулы Са(cid:23)АТРазы. После гидролиза фосфо(cid:23)
интермедиата фермент возвращается из состояния Е2 в Е1, что сопровождается
плазматических доменов.
движением гидрофильных доменов его молекулы в обратном направлении.
Это предположение было полностью подтверждено данными рент(cid:23)
геноструктурного анализа, проведенного с использованием кристал(cid:23)
лов Са(cid:23)АТРазы, зафиксированной в пяти разных конформационных
сближается с N(cid:23)доменом (рис. 4). Изменяется и характер его связей с
состояниях: Е1–Са, Е2–TG, Са–Е1–АМРРСР (аналог состояния
Р(cid:23)доменом, что приводит к более компактной упаковке гидрофиль(cid:23)
Са–Е1–АТР), Са–Е1–AlF–ADP (аналог состояния фермента сразу
x ной части молекулы Са(cid:23)АТРазы (рис. 5). Благодаря этим перестрой(cid:23)
после гидролиза АТР) и Е2–MgF2– (аналог состояния Е2–Р). К мо(cid:23)
4 кам формируется плотное гидрофобное окружение фосфорилирован(cid:23)
менту написания настоящего обзора были получены данные только о
ного остатка Asp351, и только после этого ацилфосфат атакуется опре(cid:23)
структуре двух первых конформеров фермента [23, 62], однако авторы
деленной молекулой воды в присутствии ионов Mg2+.
отмечают, что каждый из исследованных интермедиатов имеет свою,
Основной конформационный переход Са(cid:23)АТРазы из состояния
характерную структуру [28]. Так, при переходе фермента из кон(cid:23)
Е1 в Е2 сопровождается значительными перестройками не только гид(cid:23)
формации Е1 в Е2 А(cid:23)домен Са(cid:23)АТРазы поворачивается на 110° и
рофильной части молекулы, но и ее трансмембранного домена,
248 А.М.Рубцов Са(cid:30)АТРаза саркоплазматического ретикулума… 249
Рис. 5. Конформация молекулы Са(cid:23)АТРазы в состояниях Е1Са2+ (левая часть
рисунка, фиолетовый цвет) и Е2(TG) (правая часть рисунка, зеленый цвет) в
мембране СР [28].
Рис. 6. Перестройки трансмембранных α(cid:23)спиралей (вид в плоскости мембраны)
α(cid:23)Спирали показаны в виде цилиндров и пронумерованы в доменах А, Р и
в гидрофобном домене Са(cid:23)АТРазы при переходе молекулы фермента из конфор(cid:23)
трансмембранном домене, β(cid:23)складки показаны в виде плоских стрелок. Крас(cid:23)
мации Е1 (фиолетовый цвет) в Е2 (зеленый цвет) [28].
ные пунктирные стрелки показывают направление движения гидрофильных
доменов N, Р и А при переходе фермента из конформации Е1 в Е2. Голубые α(cid:23)Спирали показаны в виде цилиндров и пронумерованы. В правой части
окружности I и II в левой части рисунка показывают расположение Са(cid:23)связы(cid:23) рисунка изображение повернуто на 90° и не показаны спирали М8 и М9, чтобы
вающих центров в гидрофобном домене фермента, а голубая пунктирная стрелка более четко было видно изменение положения в мембране спиралей М5, М4 и
в правой части рисунка указывает на возможный путь, по которому ионы Са2+ М2. Некоторые аминокислотные остатки показаны в однобуквенном коде. Крас(cid:23)
из цитоплазмы могут проникнуть в эти центры. ные пунктирные стрелки показывают движение α(cid:23)спиралей при конформа(cid:23)
ционном переходе Е1–Е2. Голубая пунктирная стрелка в левой части рисунка
показывает возможный путь, по которому ионы Са2+ могут проникать со стороны
цитоплазмы в центры связывания. Красными точками в правой части рисунка
содержащего участки связывания Са2+ [28]. Из четырех спиралей,
показаны участки, в которых происходит вращение спиралей М2 и М5.
формирующих Са(cid:23)связывающие центры (М4, М5, М6 и М8), только
спираль М8 практически не изменяет своего положения в мембране.
продемонстрирована в независимых экспериментах с помощь ЯМР(cid:23)
Спираль М4 сдвигается на один виток внутрь полости СР, верхняя
спектроскопии [63]. Было высказано предположение, что изменение
(цитоплазматическая) часть спирали М5, имеющей два излома, нак(cid:23)
структуры этой спирали и аналогичные перестройки в спирали М6
лоняется в сторону спирали М4, а деспирализованная часть спирали
играют важную роль в связывании и окклюзии ионов Са2+ в процессе
М6 поворачивается на 90° (рис. 6). Такие изменения приводят к нару(cid:23)
работы Са(cid:23)АТРазы.
шению структуры Са(cid:23)связывающих участков, причем движение спи(cid:23)
При конформационном переходе Е1–Е2 происходит сближение
рали М4, вероятно, обеспечивает освобождение ионов Са2+ внутрь рети(cid:23)
гидрофильных доменов Са(cid:23)АТРазы А с Р и А с N и формирование
кулума и их замещение протонами. Высокая подвижность и способ(cid:23)
между ними нескольких новых водородных связей. При этом N(cid:23)кон(cid:23)
ность к излому спирали М5 в области остатков Ile765–Аsp768 была
250 А.М.Рубцов Са(cid:30)АТРаза саркоплазматического ретикулума… 251
цевая часть спирали М1, которая в конформационном состоянии фер(cid:23) Са(cid:23)АТРаза в конформации Е1 имеет высокое сродство к АТР, а после
мента Е1 глубоко погружена в мембрану СР, изгибается и «ложится» перехода фермента в состояние Е2 и освобождения продуктов реак(cid:23)
на цитоплазматическую поверхность мембраны [28]. По(cid:23)видимому, ции активный центр приобретает низкое сродство к субстрату. Ско(cid:23)
эти перестройки закрывают доступ к Са(cid:23)связывающим участкам рость гидролиза АТР Са(cid:23)АТРазой лимитируется скоростью конфор(cid:23)
Са(cid:23)АТРазы со стороны цитоплазмы. Путь для выхода Са2+ в люмен мационного перехода Е2(cid:23)Е1, поэтому связывание АТР с гидролити(cid:23)
ретикулума открывается, главным образом, за счет изменения поло(cid:23) ческим центром Е2(cid:23)конформера Са(cid:23)АТРазы (имеющим низкое срод(cid:23)
жения спирали М4 (рис. 6). Таким образом, данные рентгеноструктур(cid:23) ство к нуклеотиду) приводит к образованию фермент(cid:23)субстратного
ного анализа позволили значительно продвинуться в понимании меха(cid:23) комплекса и значительно ускоряет конформационный переход из
низма функционирования Са(cid:23)АТРазы СР и других АТРаз Р(cid:23)типа. состояния Е2–АТР в состояние Е1–АТР (реакция протекает по пути
релаксационной кинетики) [72]. Релаксационная кинетика пред(cid:23)
полагает существование гетерогенных активных центров только в
VI. ОСОБЕННОСТИ КИНЕТИКИ Са(cid:3)АТРазы
условиях гидролиза субстрата. Однако опыты по защите активности
Интересной особенностью Са(cid:23)АТРазы СР является тот факт, что Са(cid:23)АТРазы нуклеотидами от инактивации тиоловыми агентами (в
зависимость ее активности от концентрации АТР не описывается частности АТР и АDP) демонстрируют наличие нуклеотидсвязываю(cid:23)
уравнением Михаэлиса(cid:23)Ментен, так как в области высоких концент(cid:23) щих центров с разным сродством к АТР и у неработающего фермента,
раций субстрата (0,5–1,0 мМ) наблюдается дополнительная актива(cid:23) зафиксированного в состоянии Е1 [73, 74].
ция фермента [64]. Было установлено, что график зависимости актив(cid:23) В ряде работ дополнительная активация фермента высокими кон(cid:23)
ности Са(cid:23)АТРазы от концентрации АТР в координатах Лайнуивера(cid:23) центрациями АТР объясняется наличием второго – регуляторного
Берка имеет вид двух пересекающихся прямых. Рассчитанные на или аллостерического нуклеотидсвязывающего центра в молекуле
основе этих экспериментов значения К для АТР составили 10 мкМ в Са(cid:23)АТРазы [75, 76]. Так, с использованием негидролизуемого аналога
области низких концентраций субстрамта (до 100 мкМ) и 400 мкМ в АТР – 3'(cid:23)арилазидо(cid:23)АТР было показано наличие двух участков свя(cid:23)
области высоких концентраций нуклеотида (свыше 100 мкМ) [14, зывания субстрата на одной молекуле фермента [77]. Предполагается,
64]. Негиперболическая зависимость активности от концентрации что регуляторный центр имеет низкое сродство к нуклеотиду, но свя(cid:23)
субстрата характерна и для других АТРаз Р(cid:23)типа, например, для Na,K(cid:23) зывание с ним АТР активирует гидролиз субстрата в каталитическом
ATРазы плазматических мембран [65] и Н,К(cid:23)АТРазы слизистой центре, который имеет высокое сродство к субстрату [78]. В то же
желудка [66]. время опыты по фосфорилированию, связыванию АТР, ADP, а также
Негиперболическая зависимость скорости гидролиза АТР Ca(cid:23)АТР(cid:23) их негидролизуемых аналогов с Са(cid:23)АТРазой СР показывают, что с
азой от концентрации субстрата получила название субстратной ак(cid:23) одной молекулой фермента взаимодействует только одна молекула
тивации или аллостерического действия АТР. Для объяснения такого нуклеотида [14], последние данные рентгеноструктурного анализа
кинетического поведения фермента было выдвинуто несколько гипо(cid:23) также не подтверждают наличия второго нуклеотидсвязывающего
тез, однако пока ни одна из них не является окончательно доказанной. центра [23, 62].
Негиперболическая зависимость активности фермента от кон(cid:23) Еще одно объяснение дополнительной активации Са(cid:23)АТРазы вы(cid:23)
центрации субстрата может наблюдаться при наличии в препаратах сокими концентрациями АТР заключается в том, что такая активация
нескольких изоформ, которые обладают разными кинетическими может быть связана с присутствием в мембранах СР олигомерных
характеристиками – сродством к субстрату и скоростью его гидро(cid:23) комплексов фермента, взаимодействие мономеров в которых и при(cid:23)
лиза. Однако к настоящему времени накоплено много данных, поз(cid:23) водит к нарушению нормальной Михаэлисовской кинетики. О при(cid:23)
воляющих исключить эту гипотезу: в препаратах СР скелетных мышц сутствии в мембранах СР олигомерных комплексов Са(cid:23)АТРазы раз(cid:23)
кролика, на которых проводилось большинство экспериментов, не ного состава говорят многочисленные данные [79–81], причем в ряде
обнаружено различных изоформ Са(cid:23)АТРазы [20, 24, 67–69]. случаев результаты экспериментов наиболее хорошо описываются
Многие исследователи считают, что ион(cid:23)транспортирующие моделями, предполагающими наличие кооперативных взаимодей(cid:23)
АТРазы Р(cid:23)типа имеют один активный центр, меняющий свое срод(cid:23) ствий между нуклеотидсвязывающими центрами мономеров Са(cid:23)АТР(cid:23)
ство к АТР в ходе реакционного цикла [70, 71]. Предполагается, что азы в составе олигомерных комплексов [82, 83]. Более подробно воп(cid:23)
252 А.М.Рубцов Са(cid:30)АТРаза саркоплазматического ретикулума… 253
рос об олигомерной организации Са(cid:23)АТРазы в мембранах СР будет Gly626 и Asp627 важны для связывания АТР, нормального взаимо(cid:23)
обсуждаться ниже. действия N(cid:23) и Р(cid:23)доменов и образования фосфофермента [94]. На
Известно, что кроме АТР Са(cid:23)АТРаза способна гидролизовать и сегодняшний день можно считать, что не существует аминокислот(cid:23)
другие нуклеозидтрифосфаты: CTP, GTP, ITP, UTP [84]. Если принять ного остатка, модификация которого имеет решающее значение для
скорость гидролиза АТР за 100%, то скорость гидролиза ITP составит АТР(cid:23)связывающих свойств Са(cid:23)АТРазы. АТР(cid:23)связывающий центр
80%, GTP – 70%, CTP – 55%, UTP – 25%. Кроме нуклеозидтрифос(cid:23) формируется из нескольких последовательностей аминокислот, доста(cid:23)
фатов Са(cid:23)АТРаза гидролизует ацетилфосфат [85], п(cid:23)нитрофенилфос(cid:23) точно далеко «разнесенных» по первичной структуре фермента [69].
фат [86–88], карбамаилфосфат [85], динитрофенилфосфат [89], сук(cid:23) Результаты всех этих исследований, как и данные рентгенострук(cid:23)
цинилфосфат и бензоилфосфат [85]. Все эти соединения гидролизу(cid:23) турного анализа [23, 62], свидетельствуют о наличии в молекуле
ются Са(cid:23)АТРазой и обеспечивают перенос ионов кальция через мем(cid:23) Са(cid:23)АТРазы СР только одного нуклеотидсвязывающего участка.
брану СР [89, 90]. В отличие от АТР, гидролиз других нуклеозидтри(cid:23) Пока известны только два случая, когда не наблюдалась актива(cid:23)
фосфатов, п(cid:23)нитрофенилфосфата, ацетилфосфата, ацилфосфатов и ция Са(cid:23)АТРазы высокими концентрациями АТР. Так, у холодоустой(cid:23)
синтетических субстратов описывается кинетикой Михаэлиса [85, чивой лягушки Rana sylvatica зависимость активности Са(cid:23)АТРазы СР
88, 89], и для них приводится одно значение К . Таким образом, эти скелетных мышц (изоформа SERCA1) от концентрации АТР описы(cid:23)
м
субстраты не обладают аллостерическим действием, характерным для вается кинетикой Михаэлиса(cid:23)Ментен [95]. По сравнению с Са(cid:23)АТР(cid:23)
АТР, который в высоких концентрациях обеспечивает дополнитель(cid:23) азой СР других лягушек первичная структура этого фермента содер(cid:23)
ную активацию фермента. Гидролиз этих соединений по ряду пара(cid:23) жит всего 7 аминокислотных замен, три из которых (Leu546Asn,
метров значительно отличается от гидролиза АТР. Так, гидролиз UTP Ser547Ala и Gly643Ser) находятся в АТР(cid:23)связывающем домене.
Са(cid:23)АТРазой СР не ингибируется циклопиазониевой кислотой, сте(cid:23) Поскольку аминокислоты, располагающиеся в этих участках, кон(cid:23)
хиометрия транспорта Са2+ составляет 0,7–0,8 на моль нуклеотида, а не сервативны в Са(cid:23)АТРазе СР большинства видов животных, предпо(cid:23)
2, как в случае АТР, при гидролизе UTP не накапливается ADP(cid:23)чувст(cid:23) лагается, что их замена приводит к изменению белок(cid:23)белковых взаи(cid:23)
вительня форма фосфорилированного интермедиата, а связанный с модействий в составе олигомерных комплексов Са(cid:23)АТРазы Rana
фосфорилированным ферментом Са2+ легко освобождается в цито(cid:23) sylvatica, вследствие чего не наблюдается дополнительной активации
плазму [91]. Кроме того, только связывание АТР с Са(cid:23)АТРазой, но не этого фермента высокими концентрациями АТР, которая, по мнению
других нуклеозидтрифосфатов, изменяет сродство Са(cid:23)связывающих авторов, объясняется именно наличием в мембранах ретикулума оли(cid:23)
центров фермента и скорость связывания Са2+ [53, 54]. гомерных комплексов молекул фермента [95].
Свойства нуклеотидсвязывающего центра Са(cid:23)АТРазы изучались Исследование активности Са(cid:23)АТРазы СР скелетных мышц сус(cid:23)
главным образом с помощью химической модификации входящих в лика Spermophilus undulatus, проведенные в нашей лаборатории, пока(cid:23)
его состав аминокислот с использованием аналогов АТР, способных зали, что в летний период зависимость активности фермента от кон(cid:23)
ковалентно связываться с белком, а также с помощью направленного центрации АТР характеризуется дополнительной активацией в области
точечного мутагенеза. Обработка АТРазы FITC, который ковалентно высоких концентраций субстрата (рис. 7). В то же время, активность
связывается с остатком Lys515 [92, 93], приводит к тому, что фермент фермента, полученного из скелетных мышц зимних спящих живот(cid:23)
теряет способность связывать АТР, но при этом не изменяется его ных, снижена в 2 раза, причем это снижение связано с устранением
взаимодействие с небольшими по размеру молекулами субстратов, активации Са(cid:23)АТРазы высокими концентрациями АТР [96, 97].
такими как ацетилфосфат и п(cid:23)нитрофенилфосфат. Это говорит о том, Поскольку в зимний период в мембранах СР скелетных мышц сусли(cid:23)
что остаток Lys515 находится вблизи нуклеотидсвязывающего центра ков значительно изменяются белковый состав и эндогенная протеин(cid:23)
и связывание с ним достаточно крупной по размеру молекулы FITC киназная активность, предполагается, что активность Са(cid:23)АТРазы в
стерически препятствует связыванию нуклеотида. СР этих животных регулируется уровнем экспрессии и/или уровнем
С помощью направленного мутагенеза входящих в состав N(cid:23)до(cid:23) фосфорилирования пока неидентифицированных белков, взаимо(cid:23)
мена высококонсервативных последовательностей, характерных действующих с Са(cid:23)АТРазой [96–98].
для всех ион(cid:23)транспортирующих АТРаз Р(cid:23)типа (KGAPE(cid:23)519 и Отсутствие дополнительной активации фермента высокими кон(cid:23)
RDAGIRVIMITGDNK(cid:23)629), удалось выяснить, что только остатки центрациями АТР описано также еще для одного представителя АТРаз
