Biologische Anwendungen der Fluoreszenz-Nahfeldmikroskopie

183 Pages·1998·7.69 MB·German

Biologische Anwendungen der
Fluoreszenz-Nahfeldmikroskopie
Dissertation
zur Erlangung des akademischen Grades
des Doktors der Naturwissenschaften
(Dr. rer. nat)
vorgelegt von
Achim Klaus Kirsch
Universit(cid:127)at Konstanz
Fakult(cid:127)at fu(cid:127)r Physik
September 1998
Dissertation der Universität Konstanz
Datum der mündlichen Prüfung: 28. 10. 1998
Referent: Prof. Dr. J. Mlynek
Referent: Prof. Dr. P. Leiderer
Die Arbeit ist im Cuvillier Verlag Göttingen erschienen.
ISBN 3-89712-366-5
Kontakt: CUVILLIER VERLAG
Nonnenstieg 8, 37075 Göttingen
Tel.: 0551 - 54724 - 0
Fax.: 0551 - 54724 - 21
Inhaltsverzeichnis
Zusammenfassung 1
1 Einleitung 4
1.1 Das Au(cid:13)(cid:127)osungsverm(cid:127)ogen optischer Instrumente . . . . . . . . . . . . . . . 8
1.1.1 Laterale Au(cid:13)(cid:127)osung im Fernfeld . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8
1.1.2 Laterale Au(cid:13)(cid:127)osung im Nahfeld . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12
1.2 Das optische Nahfeld: theoretische Beschreibungen . . . . . . . . . . . . . . 14
1.3 Experimentelle Techniken . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20
1.3.1 Nahfeldoptische Sonden . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21
1.3.2 Abstandsregelmechanismen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24
1.4 Anwendungen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24
2 Nahfeldmikroskopie mit Glasfaserspitzen 26
2.1 Modell fu(cid:127)r die Nahfeldmikroskopie im shared-aperture-Modus . . . . . . . . 29
2.2 Berechnung der Moden der du(cid:127)nnen Glasfaser . . . . . . . . . . . . . . . . . 30
2.3 Abbildungseigenschaften des Fasermodells . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39
3 Aufbau des optischen Nahfeldmikroskops 43
3.1 Die Faserspitze . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44
3.2 Der Sensorkopf . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45
3.3 Experimente zum Scherkraftmechanismus . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 49
3.4 Scherkraftmikroskopische Abbildung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52
3.5 Hellfeldre(cid:13)exionsaufbau . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 55
3.5.1 Aufbau der Hellfelddetektion. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 55
3.5.2 Detektion synchron zur Faserschwingung . . . . . . . . . . . . . . . 57
3.6 Fluoreszenz-Nahfeldmikroskopie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 60
3.6.1 Aufbau des Fluoreszenz-Nahfeldmikroskops . . . . . . . . . . . . . . 63
3.6.2 Der Moden(cid:12)lter . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 65
4 Anwendungen des Fluoreszenz-Nahfeldmikroskops 71
4.1 LB-Filme mit Metallkomplexdiade . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 72
4.1.1 Die Ru(II)-Rh(III)-Metallkomplexdiade . . . . . . . . . . . . . . . . 73
4.1.2 LB-Filmherstellung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 75
4.1.3 Die Diade an der Wasserober(cid:13)(cid:127)ache . . . . . . . . . . . . . . . . . . 77
4.1.4 Die Diade in LB-Filmen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 78
4.1.5 Modell des LB-Films . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 86
4.2 FRET . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 90
4.2.1 Experimenteller Aufbau . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 93
4.2.2 Akzeptorbleichen FRET . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 95
4.2.3 Donorbleichen FRET auf PVA-Filmen . . . . . . . . . . . . . . . . 97
4.2.4 Donorbleichen FRET auf Zellen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 101
4.2.5 Diskussion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 103
4.3 Fluoreszenz-Nahfeldmikroskopie an GFP in Zellen . . . . . . . . . . . . . . 106
4.3.1 Das Green Fluorescent Protein (GFP) . . . . . . . . . . . . . . . . 107
4.3.2 GFP in E.coli-Bakterien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 111
4.3.3 GFP in Drosophila-Schneiderzellen . . . . . . . . . . . . . . . . . . 116
4.3.4 ErbB-1{EGFP-Fusionsprotein . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 119
4.3.5 Diskussion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 120
5 Zweiphotonen-Nahfeldmikroskopie 122
5.1 Fluoreszenzanregung durch Zweiphotonenabsorption . . . . . . . . . . . . . 124
5.2 Experimentelle Techniken . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 126
5.2.1 Optischer Aufbau . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 126
5.2.2 Fluoreszenz-Leistungskurven . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 129
5.2.3 Fluoreszenz-Abstandskurven . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 130
5.3 Anwendung der Zweiphotonenanregung im Nahfeldmikroskop . . . . . . . . 131
5.3.1 Fluoreszenz-Nahfeldmikroskopie mit Zweiphotonenanregung . . . . 131
5.3.2 Fluoreszenz-Leistungskurven . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 143
5.3.3 Fluoreszenz-Abstandskurven . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 148
5.3.4 Bleichexperimente . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 153
5.4 DiskussionzurMehrphotonenabsorptionineinemoptischenNahfeldmikroskop154
6 Ausblick 157
Literaturverzeichnis 161
Danksagung 179
Zusammenfassung
Die vorliegende Arbeit befa(cid:25)t sich mit dem Aufbau und der Anwendung eines optischen
Nahfeldmikroskops, welches fu(cid:127)r Untersuchungen an biologischen Proben entworfen wur-
de. Mit diesem Mikroskop k(cid:127)onnen simultan mit der Probentopographie optische Signale
mit einer Aufl(cid:127)osung jenseits der Abbeschen Au(cid:13)(cid:127)osungsgrenze aufgezeichnet werden. Ne-
ben der Entwicklung der notwendigen nahfeldoptischen Techniken und Methoden wurde
insbesondere auf die Implementation der aus der optischen Fernfeldmikroskopie bekannten
Kontrastmechanismen Wert gelegt. Dies ist wichtig, wenn die optische Nahfeldmikroskopie
ein fu(cid:127)r die Biologie bedeutendes hilfreiches Analysewerkzeug werden soll.
Ausgehend von der Erfahrung, da(cid:25) die Herstellung der g(cid:127)angigen Apertursonden gro(cid:25)e
Problemebezu(cid:127)glichderReproduzierbarkeitaufweist,wurdendielektrischeGlasfaserspitzen
als lokale Sonden fu(cid:127)r das optische Nahfeld ausgew(cid:127)ahlt. Sie k(cid:127)onnen sehr gut reproduzierbar
hergestelltwerden unddienenimshared-aperture-ModussowohlzurBeleuchtungderProbe
als auch zum Aufsammeln des von der Probe stammenden Lichtes. Fu(cid:127)r die Absch(cid:127)atzung
der theoretisch erzielbaren Au(cid:13)(cid:127)osung wurden die Faserspitzen als du(cid:127)nne Glasfasern in Luft
modelliert. Aus der Form der in der Glasfaser gefu(cid:127)hrten Moden ergibt sich, da(cid:25) bei einer
Lichtwellenl(cid:127)ange von 488 nm Punkte mit einem Abstand von 120 nm aufgel(cid:127)ost werden
k(cid:127)onnen.
Da biologische Proben in der Regel erhebliche Variationen in der Dicke aufweisen,
wurde das Mikroskop mit einer Scherkraftdetektion ausgestattet, die es erlaubt, die Sonde
der Probentopographie nachzufu(cid:127)hren. Die Sensitivit(cid:127)at der Scherkraftdetektion reichte aus,
einzelne Plasmid-DNA-Moleku(cid:127)le auf einer Glimmerober(cid:13)(cid:127)ache abzubilden.
Als erster optischer Kontrastmechanismus wurde die Hellfeldre(cid:13)exion aufgebaut. Ne-
ben dem Gleichanteil des Re(cid:13)exionssignals kann auch ein synchron zur Faserschwingung
modulierter Anteil detektiert werden, der es sogar erlaubt, die Schwingungsrichtung der
1
2 Zusammenfassung
Faser bei der Scherkraftdetektion zu bestimmen. Bilder, die sich aus der Aufzeichnung des
Re(cid:13)exionssignals ergeben, k(cid:127)onnen Strukturen mit Gr(cid:127)o(cid:25)en im Bereich von 70 nm, ohne
Korrelation zu Strukturen im Topographiebild, aufweisen. Die Interpretation dieser Bilder
ist jedoch sehr schwierig.
Als zweiter Kontrastmechanismus wurde die Detektion des Fluoreszenzsignals reali-
siert. In diesem Modus kann neben der statischen Fluoreszenzemission auch die Bleichrate
und die integrierte Fluoreszenzemission der Probe bestimmt werden. Aus diesen Daten
kann die Verteilung von Fluorophoren, unabh(cid:127)angig von deren Fluoreszenzquantenausbeu-
ten, bestimmt werden. Dies wurde am Beispiel von Langmuir-Blodgett-Filmen, die eine
Ru(II)-Rh(III)-Metallkomplexdiadeenthalten,demonstriert.MiteinemMehrschichtmodell
fu(cid:127)r den aus Diade und Stearins(cid:127)aure bestehenden Film k(cid:127)onnen die optischen Daten und die
mit einem Kraftmikroskop und der Scherkraftdistanzregelung bestimmte Topographie des
Filmes konsistent erkl(cid:127)art werden.
Eine weitere wichtige Methode bei der Fluoreszenzmikroskopie ist die Messung des
Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfers (FRET) von einem angeregten Donormoleku(cid:127)l auf
einAkzeptormoleku(cid:127)l.DiesbietetdieM(cid:127)oglichkeit,Abst(cid:127)ande aufeinerL(cid:127)angenskalavon1bis
10nmzumessen.ImRahmendieserArbeitwurde zumerstenMalderEnergietransferu(cid:127)ber
die Methoden des Akzeptor- und des Donorbleichens im Nahfeldmikroskop nachgewiesen.
Die bei der Methode des Donorbleichens aufgezeichneten Bleichkurven werden sowohl mit
einem einfachen Modell, bei dem ein einziger Abstand zwischen den Moleku(cid:127)len angenom-
men wird, als auch mit einem Modell, welches der statistischen Verteilung der Moleku(cid:127)le
im Film Rechnung tr(cid:127)agt, simuliert.
In der Zell- und Entwicklungsbiologie sind das green (cid:13)uorescent protein (GFP) und
seine Mutanten sehr wichtige (cid:13)uoreszente Markermoleku(cid:127)le. Mit dem Nahfeldmikroskop
wurden verschiedene Zellkulturen untersucht, die verschiedene Mutanten des GFP expre-
mieren.E.coli-Bakterienreichern dasProteinimwesentlichen homogeninihremZellk(cid:127)orper
an und zeigen, abh(cid:127)angigvon der expremierten GFP-Mutante, nur Ver(cid:127)anderungen der Mor-
phologie. Im Gegensatz dazu bilden sich in Drosophila-Schneiderzellen, die eine fu(cid:127)r die
Expression in Drosophila optimierte GFP-Mutante expremieren, Einschlu(cid:25)k(cid:127)orper, die als
diskrete helle Punkte mit Durchmessern von 150 bis 400 nm abgebildet werden. Diese
Messungen zeigen, da(cid:25) auch Fluoreszenzsignale aus dem Innern von getrockneten Zellen
detektiert werden k(cid:127)onnen. Mit einem an das Nahfeldmikroskop angeschlossenen Spektro-
graphen wurde nachgewiesen, da(cid:25) die in diesen Pr(cid:127)aparaten beobachtete Fluoreszenz von
dem GFP stammt.
3
Die Zweiphotonenanregung von Farbsto(cid:11)en in der Fernfeldmikroskopie bietet den gro-
(cid:25)en Vorteil, da(cid:25) die Anregung der Moleku(cid:127)le nur im Fokus erfolgt. Dadurch ergibt sich eine
inh(cid:127)arente dreidimensionale Au(cid:13)(cid:127)osung und ein verbessertes Signal-zu-Hintergrund-Verh(cid:127)alt-
nis.ImRahmen dieserArbeitwurde erstmalsdieAnregung von Farbsto(cid:11)en u(cid:127)ber diesimul-
taneAbsorptionvonzweiPhotonenmiteinemDauerstrichlaserimoptischenNahfeldmikro-
skop realisiert. Dadurch ist es m(cid:127)oglich, im UV absorbierende Farbsto(cid:11)e mit rotem Licht
zur Fluoreszenz anzuregen. Au(cid:25)erdem wird die mit blauem (bzw. ultraviolettem) Licht
angeregte Auto(cid:13)uoreszenz der verwendeten Glasfaser vermieden, die sonst den Hauptbei-
tragzumHintergrundsignalliefert.Fluoreszenzmessungen angef(cid:127)arbtenPolymerkugelnmit
120 nm Durchmesser ergaben, da(cid:25) im Mittel die Kugeln um 100 nm vergr(cid:127)o(cid:25)ert abgebildet
werden. Die kleinsten beobachteten Strukturen in den Fluoreszenzbildern waren 150 nm
gro(cid:25).
Mit einem gepulsten Infrarotlaser konnte au(cid:25)erdem erstmals die simultane Anregung
von Farbsto(cid:11)en durch Zwei- und Dreiphotonenabsorption im optischen Nahfeldmikroskop
demonstriert werden. Die kleinsten mit diesem Laser durch Zweiphotonenabsorption be-
obachteten (cid:13)uoreszenten Strukturen waren etwa 190 nm gro(cid:25). Es konnte nachgewiesen
werden, da(cid:25) sich die Anregung der Fluorophore durch Zweiphotonenabsorption auf einen
Bereich um die Spitze beschr(cid:127)ankt. Insbesondere ist die Dicke der Schicht, die zum Fluores-
zenzsignalbeitr(cid:127)agt,wenigeralshalbsogro(cid:25)wienachderAnregungu(cid:127)bereinen(cid:127)aquivalenten
Einphotonenproze(cid:25).
DieErgebnissedieserArbeitzeigen,da(cid:25)einimshared-aperture-ModusarbeitendesNah-
feldmikroskop fu(cid:127)r Untersuchungen an biologischen Systemen, insbesondere auch aufgrund
der Vielfalt der m(cid:127)oglichen Kontrastmechanismen, gut geeignet ist.
1
Kapitel
Einleitung
In vielen naturwissenschaftlichen und medizinischen Bereichen hat sich die optische Mikro-
skopie als ein sehr hilfreiches Instrument zur Untersuchung kleiner Strukturen erwiesen.
Dies liegt vor allem an der Vielzahl verschiedener Kontrastmechanismen, die zur Darstel-
lung von Strukturen verwendet werden k(cid:127)onnen, und daran, da(cid:25) sich die Probe unter fast
allenBedingungen,seiesinphysiologischerPu(cid:11)erl(cid:127)osungoderinVakuum,untersuchen l(cid:127)a(cid:25)t.
Desweiteren transportiert das Licht nicht nur r(cid:127)aumliche Informationen, sondern u(cid:127)ber seine
spekrale Zusammensetzung, seine Polarisationund seine Zeitab(cid:127)angigkeitkann es noch sehr
viel mehr Informationen u(cid:127)ber die Probe enthalten.
In der Physik ist man sehr oft an den optischen Eigenschaften der Probe selbst interes-
siert,dasiedieenergetischen Eigenschaftenwiderspiegeln.Umst(cid:127)ande,diezueinerVer(cid:127)ande-
rung dieser energetischen Eigenschaften fu(cid:127)hren, k(cid:127)onnen oftmals u(cid:127)ber eine Ver(cid:127)anderung in
den Spektren nachgewiesen werden. In der Biologiehingegen ist man nur in wenigen F(cid:127)allen
an den optischen Eigenschaften des Objekts selbst interessiert. Sehr viel h(cid:127)au(cid:12)ger kommt es
vor, da(cid:25) (cid:13)uoreszierende Farbsto(cid:11)moleku(cid:127)le zugesetzt werden, um einen optischen Kontrast
zu erzeugen. Dazu wurde eine Vielzahl von Farbsto(cid:11)en mit sehr spezi(cid:12)schen Eigenschaften
entwickelt, die sich zum Beispiel an bestimmte Objekte, wie z. B. DNA oder Mitochondri-
en, binden und dadurch u(cid:127)ber Ort, Form und Gr(cid:127)o(cid:25)e dieses Objekts Aufschlu(cid:25) geben, oder
deren Emissionsspektrum vom S(cid:127)auregrad oder einer Ionenkonzentration abh(cid:127)angt und die
dadurch u(cid:127)ber diese Probeneigenschaften lokal Aufschlu(cid:25) geben. Dadurch ist es m(cid:127)oglich,
die Verteilung beziehungsweise den funktionalen Zustand von biologischen Strukturen und
von Makromoleku(cid:127)len abzubilden.
Eine interessante Erweiterung der M(cid:127)oglichkeiten der Lichtmikroskopie bieten das Kon-
fokal- und das 2-Photonen-Mikroskop. Die axiale Au(cid:13)(cid:127)osung wird durch die Einfu(cid:127)hrung
4
5
einer Blende sowohl im Beleuchtungs- als auch im Detektionslichtweg beziehungsweise
der Einschr(cid:127)ankung der Fluoreszenzanregung durch den 2-Photonen-Proze(cid:25) auf einen klei-
nen Bereich um den Fokus des Objektivs erh(cid:127)oht, so da(cid:25) die Erfassung optischer Schnitte
m(cid:127)oglich ist. Dadurch kann z. B. die dreidimensionale Verteilung der Fluoreszenz in einer
Probe bestimmt werden. Die maximale laterale Au(cid:13)(cid:127)osung wird mit diesen Mikroskopen
nicht verbessert, da die r(cid:127)aumliche Grenzfrequenz, die das optische System u(cid:127)bertr(cid:127)agt, nicht
vergr(cid:127)o(cid:25)ert wird (Inou(cid:19)e, 1995). Allerdings kann sich fu(cid:127)r andere Au(cid:13)(cid:127)osungsde(cid:12)nitionen, die
vom Verlauf der Punktabbildungsfunktion abh(cid:127)angen, eine Verbesserung ergeben. So ist
z. B. die volle Breite beim halben Maximalwert des Bildes eines Punktes im Konfokal-
mikroskop nur 73 % der entsprechenden Breite in einem normalen optischen Mikroskop
(Corle und Kino, 1996).
Eine gro(cid:25)e Einschr(cid:127)ankung der optischen Mikroskopie entsteht aus dem aufgrund von
Beugung lateral auf etwa die halbe Wellenl(cid:127)ange, typischerweise ca. 200 nm, beschr(cid:127)ank-
ten Au(cid:13)(cid:127)osungsverm(cid:127)ogen. Strukturen, die n(cid:127)aher beieinander liegen, werden nicht mehr als
getrennt wahrgenommen. Es gibt die M(cid:127)oglichkeit, die Entfernung zwischen zwei geeignet
gew(cid:127)ahlten Farbsto(cid:11)en imBereich zwischen 1 nm und 10 nm u(cid:127)ber den Fluoreszenz-Energie-
Transfer spektral zu kodieren. Allerdings bleibt damit immer noch der zwischen diesen
L(cid:127)angenskalen liegende Bereich, der der Lichtmikroskopie nicht zug(cid:127)anglich ist.
Da es jedoch sehr viele Strukturen gibt, die von der Gr(cid:127)o(cid:25)e her in diesen Bereich fallen,
wurden und werden viele Versuche unternommen, im Mikroskop eine bessere Au(cid:13)(cid:127)osung
zu erzielen. Das Au(cid:13)(cid:127)osungsverm(cid:127)ogen skaliert meist mit der Wellenl(cid:127)ange der verwende-
ten Strahlung. Daher erlauben Mikroskope, die ku(cid:127)rzerwellige Strahlung, wie zum Beispiel
R(cid:127)ontgenstrahlung oder Elektronen verwenden, kleinere Strukturen abzubilden, als es mit
dem Lichtmikroskop m(cid:127)oglich ist. Insbesondere die Elektronenmikroskopie ergab eine Viel-
zahl interessanter Ergebnisse zur Struktur von biologischen Objekten, wie zum Beispiel
den Polyt(cid:127)an-Chromosomen der Zuckmu(cid:127)cke Chironomus tetans (Pelling und Allen, 1993).
Allerdings haben diese Mikroskope { neben dem gro(cid:25)en apparativen Aufwand { auch me-
thodische Nachteile. So k(cid:127)onnen die meisten fu(cid:127)r die Lichtmikroskopie entwickelten Markie-
rungstechniken nicht mehr eingesetzt werden, und es ist nicht immer m(cid:127)oglich, w(cid:127)ahrend
der Untersuchung die fu(cid:127)r die Probe idealen Umgebungsbedingungen beizubehalten. Dies
tri(cid:11)t besonders fu(cid:127)r die Elektronenmikroskopie von biologischen Objekten zu, da im fu(cid:127)r das
Elektronenmikroskop notwendigen Vakuum Zellen weder leben, noch Moleku(cid:127)le in einem
funktionsf(cid:127)ahigen Zustand verbleiben k(cid:127)onnen.
Eine andere M(cid:127)oglichkeit, kleine Strukturen im Nanometerbereich abzubilden, bieten
6 Kapitel 1. Einleitung
die verschiedenen Rastersondenmikroskope, die seit der ersten Realisation des Rastertun-
nelmikroskops durch Binnig und Rohrer (1982) entwickelt wurden. Anstelle von Strahlung
verwenden sie sehr kleine Sonden, die mit der Probenober(cid:13)(cid:127)ache wechselwirken. Da diese
Sonden idealerweise nur einen Punktkontakt zur Probe ausbilden, mu(cid:25) die Probenober-
(cid:13)(cid:127)ache Punkt fu(cid:127)r Punkt abgetastet werden. Aus den Koordinaten der Me(cid:25)punkte und den
jeweiligen Me(cid:25)werten l(cid:127)a(cid:25)t sich dann ein zweidimensionales Bild der Verteilung der Me(cid:25)-
gr(cid:127)o(cid:25)eaufderProbenober(cid:13)(cid:127)ache gewinnen.Besonders interessanteErgebnisse hatdabeizum
Beispiel das Rastertunnelmikroskop ergeben, mit dem selbst die Ausbildung elektronischer
Ober(cid:13)(cid:127)achenwellen abgebildet werden konnte (Crommie et al., 1995).
DieVereinigungvonLichtmikroskopieundRastersondenmikroskopiewirdals optisches
"
Nahfeldmikroskop\ bezeichnet (engl. scanning near-(cid:12)eld optical microscope, SNOM). Es
bietet die M(cid:127)oglichkeit, optische Kontrastmechanismen und die fu(cid:127)r die Lichtmikroskopie
entwickelten Markierungstechniken mit einer verbesserten lateralen Au(cid:13)(cid:127)osung zu kombi-
nieren, denn die Abbildung im Nahfeldmikroskop ist im Gegensatz zu den bisher erw(cid:127)ahn-
ten optischen Mikroskopen nicht beugungsbeschr(cid:127)ankt. Au(cid:25)erdem ist die verwendete Sonde
oftmals auch zur Messung weiterer Probeneigenschaften geeignet, so da(cid:25) simultan zum op-
tischen Bildeinweiterer Informationskanal,wiez. B. dieProbentopographie,aufgezeichnet
werden kann.
DerHauptaspektdervorliegendenArbeitistdieAnwendungeinesoptischenNahfeldmi-
kroskops mitdielektrischen Faserspitzen auf vornehmlich biologischeSysteme. Dazu wurde
ein bestehendes kommerzielles Kraftmikroskop derart umgebaut, da(cid:25) das zu einer feinen
Spitze geformte Ende einer optischen Faser als lokale Sonde verwendet werden kann. Die
theoretische Analyse der Moden in einer du(cid:127)nnen Glasfaser in Kapitel 2 zeigt, da(cid:25) mit
derartigen Faserspitzen eine optische Au(cid:13)(cid:127)osung jenseits des Beugungslimits m(cid:127)oglich ist.
Der Aufbau des Mikroskops und die verwendeten Techniken zur Abstandsregelung wer-
den in Kapitel 3 vorgestellt. Messungen zum mechanischen Verhalten der Faserspitze bei
der Ann(cid:127)aherung an die Probenober(cid:13)(cid:127)ache und Beispiele fu(cid:127)r die scherkraftmikroskopische
Abbildung charakterisieren das System. Der prinzipielle Aufbau der Optik zur Detektion
der Re(cid:13)exion und Fluoreszenz werden dargestellt.
Das 4. Kapitel besch(cid:127)aftigt sich mit verschiedenen Anwendungen des optischen Nahfeld-
mikroskopes mit Fluoreszenzdetektion. Als erstes werden Untersuchungen von Langmuir-
Blodgett-Filmen,die eine Metallkomplexdiadeenthalten, vorgestellt. Die Diadezeigt einen
vektoriellen photoinduzierten Elektronentransfer, so da(cid:25)sie das erste Element eines mittels
der organischen Chemie hergestellten Systems zur Umwandlung von Licht in elektrischen