Biochemische Labormethoden: Arbeitsvorschriften und Tabellen

241 Pages·1988·4.66 MB·German

by  Dr. Martin Holtzhauer (auth.)

Heidelberger Taschenbiicher Band 249
M. Holtzhauer
Biochemische Labormethoden
Arbeitsvorschriften und Tabellen
Unter Mitarbeit von V. Hahn
Mit 13 Abbildungen und 68 Tabellen
Springer-Verlag
Berlin Heidelberg New York
London Paris Tokyo
Autor:
Dr. Martin Holtzhauer
Zentralinstitut flir Molekularbiologie der Akademie der
Wissenschaften der D D R
Robert-Rossle-StraBe 10, Berlin-Buch, DDR-1115
Mitarbeiter:
Dr. Volkmar Hahn
Zentralinstitut flir Molekularbiologie der Akademie der
Wissenschaften der D D R
Robert-Rossle-StraBe 10, Berlin-Buch, DDR-1115
ISBN-13: 978-3-540-19267-1 e-ISBN-13: 978-3-642-97111-2
DOl: IO.1007/978-3-642-97111-2
CIP-Titelaufnahme der Deutschen Bibliothek
Holtzhauer, Martin:
Biochemische Labormethoden : Arbeitsvorschriften u. Tab. / M. Holtzhauer. Unter
Mitarb. von V. Hahn. - Berlin; Heidelberg; New York; London; Paris; Tokyo:
Springer, 1988
(Heidelberger Taschenbiicher ; Bd.249)
NE:GT
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© Springer-Verlag Berlin Heidelberg 1988
Softcover reprint of the hardcover I st edition 1988
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2151/3140-5 4 3 2 1 0 - Gedruckt auf saurefreiem Papier
Vorwort
Biochemische Methoden flieBen in immer zahlreichere
benachbarte Wissensbereiche ein. Fur die Losung der jewei
ligen Aufgaben werden altbewahrte ebenso wie erst vor
wenigen lahren publizierte Laborverfahren benotigt.
Meist besitzt der in den biowissenschaftlichen Disziplinen
Arbeitende eine Vielzahl von ausgefeilten Spezialvorschrif
ten fUr die Losung der unmittelbaren Arbeitsaufgaben, fur
nicht taglich benotigte Methoden ist man jedoch auf die
Suche in der Fachliteratur angewiesen, und nicht immer laBt
sich die in einer Publikation beschriebene Methode ohne
Schwierigkeiten nacharbeiten. Aus dieser Erfahrung heraus
resultiert das Bemuhen, eine begrenzte Auswahl von Labor
vorschriften und Tabellen zusammenzustellen, die auf ihre
Praktikabilitat hin uberpriift wurden und die hiermit den im
Titel genannten Fachkollegen in der Form von Arbeitsvor
schriften vorgelegt werden in der Hoffnung, daB ihre
Beschreibung so erfolgte, daB bei einiger Laborpraxis ein
muheloses und erfolgreiches Nacharbeiten moglich ist.
Die Auswahl wurde unter dem Gesichtspunkt getroffen,
moglichst vielseitig verwendbare Labormethoden aufzuneh
men, aber selbstverstandlich waltet in jeder Auswahl eine
gewisse Willkur. Ebenso konnen die "Biochemischen Labor
methoden" nicht die Originalliteratur ersetzen, die in der
Regel bei den Vorschriften oder Kapiteleinleitungen als
Quelle angegeben wurde. Auch wurde auf die Aufnahme
von Analysenverfahren fUr spezielle Substanzen und
Enzyme verzichtet, da fUr dieses Gebiet eine Beschrankung,
die der Handlichkeit dieser Arbeitsblatter dienen sollte,
unmoglich erscheinen laBt. Es wurde auch bewuBt auf
Erlauterungen zur Theorie der vorgestellten Methoden ver
zichtet. Entsprechende einfuhrende Literatur ist sicherlich in
der unmittelbaren Umgebung des Nutzers der "Biochemi
schen Labormethoden" zu finden.
VI Vorwort
Der Zweck dieser Zusammenstellung ware erfUllt, wenn
sie als praktisches Hilfsmittel im Labor die tagliche Routine
erleichterte oder zur eigenen Sammlung von bewahrten Vor
schriften anregen wurde. Besonders soll aber erreicht wer
den, die Scheu vor einer Erweiterung des individuellen
Methodenspektrums abzubauen und die Arbeitsmethoden,
sowohl die der Originalliteratur als auch die hier vorgelegten
und die eigenen, kritisch zu uberprufen und zu erweitern.
Schlief3lich sei allen Kollegen, die durch eine angeregte
Diskussion die Zusammenstellung dieser Methodensamm
lung forderten und einer ersten kritischen Uberprufung
unterzogen, herzlich gedankt. Ganz besonderer Dank
gebuhrt Herrn Prof. Dr. H. Bielka, Berlin-Buch, fUr seine tat
kraftige UnterstUtzung wahrend der Abfassung des Manu
skripts.
Dem Vorstand, Herrn Prof. Dr. H. Glossmann, und den
Kollegen des Instituts fUr Biochemische Pharmakologie der
Universitat Innsbruck bin ich zu ganz besonderem Dank fUr
die anregenden Diskussionen, freundschaftlich-kritischen
Hinweise und die Moglichkeit zur technischen Bewaltigung
der Manuskriptarbeiten verpflichtet.
Berlin-Buch Martin Holtzhauer
Inhaltsverzeichnis
1 Quantitative Methoden . . . . . . . . . . 1
1.1 Quantitative Proteinbestimmungen . . . . . 1
1.1.1 Proteinbestimmung nach Lowry u. Mitarb. 2
1.1.2 Proteinbestimmung nach Lowry u. Mitarb.
in Gegenwart storender Begleitsubstanzen . 4
1.1.3 Proteinbestimmung nach Bradford . . . . . 5
1.1.4 Proteinbestimmung in Probenlosungen fUr die
SDS-Gelelektrophorese . . . . . . . . . 6
1.1.5 Proteinbestimmung mit Amidoschwarz 7
1.1.6 Mikro-Biuret-Methode ........ . 8
1.1.7 Proteinbestimmung durch UV-Messung 8
1.2 Quantitative N ukleinsaurebestimmungen 9
1.2.1 DNS-, RNS- und Proteintrennungsgang nach
Schmidt und Thannhauser ..... . 9
1.2.2 RNS-Bestimmung mit Orcin .... . 10
1.2.3 DNS-Bestimmung mit Diphenylamin 10
1.2.4 DNS- bzw. RNS-Bestimmung in
Gewebehomogenaten . . . . . . . . . 11
1.2.5 Quantitative Nukleinsaurebestimmung durch
UV-Messung ................ . 12
1.3 Quantitative Phosphatbestimmungen. . . . 15
1.3.1 Bestimmung von anorganischem Phosphat 15
1.3.2 Bestimmung von Gesamt-Phosphat 15
1.3.3 Phospholipid-Bestimmung 17
1.4 Monosaccharid-Bestimmung . . . . 17
2 Gelelektrophoretische Methoden . 19
2.1 Elektrophoresesysteme ...... . 19
2.1.1 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese nach
Laemmli ................... . 21
VIII Inhaltsverzeichnis
2.1.2 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese nach
Weber, Pringle und Osborn . . . . . . . . . . 24
2.1.3 Harnstoff-SDS-Polyacrylamid-
Gelelektrophorese . . . . . . . . . . . . . . 26
2.1.4 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese bei
ph 2.4 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27
2.1.5 Harnstoff-Polyacrylamid-Gelelektrophorese bei
ph 2 ......................... 29
2.1.6 Anodisches diskontinuierliches Polyacrylamid-
Gelelektrophoresesystem ......... 30
2.1.7 Kathodisches diskontinuierliches
Polyacrylamid-Gelelektrophoresesystem . 31
2.1.8 Zweidimensionale Polyacrylamid-
Gelelektrophorese (O'Farrel-Technik) . . . . .. 32
2.1.9 Nicht-denaturierende Nukleinsaure
Elektrophorese . . . . . . . . . . . . . 35
2.1.10 Denaturierende Nukleinsaure-Elektrophorese . 37
2.1.11 Identifizierung von Phosphoaminosauren . . .. 38
2.2 Hilfsmittel fUr die Kontrolle der Elektrophorese 40
2.2.1 Markerfarbstoffe fUr die Kontrolle der
Elektrophorese . . . . . . . . . . .. ..... 40
2.2.2 Eichproteine fUr die Polyacrylamid
Gelelektrophorese . . . . . . . . . . 41
2.2.3 Kovalente Farbmarkierung von Eichproteinen 42
2.3 Farbemethoden. . . . . . . . . . . . . . . . . 43
2.3.1 Proteinfarbung mit organischen Farbstoffen . 43
2.3.2 Silberfarbung von Proteinen
(Glutaraldehyd-Fixierung) ........... 45
2.3.3. Silberfarbung von Proteinen
(Formaldehyd-Fixierung) .. . .... 47
2.3.4 Silberfarbung von Glycoproteinen und
Polysacchariden . . . . . . . . . . . . . 48
2.3.5 Abschwachen von silbergefarbten Gelen . . .. 49
2.3.6 Farbung von Proteinen auf Nitrocellulose mit
Tusche. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50
2.3.7 Farbung auf Nitrocellulose mit kolloidalem
Gold. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51
Inhaltsverzeichnis IX
2.3.8 Farbung von Proteolipiden bzw. Lipiden und
Lipoproteinen ................ .. 51
2.3.9 Farbung von Glycoproteinen und
Polysacchariden mit Schiffschem Reagenz
(PAS staining) ........ . . . . . . . . 52
2.4 Elektroelution aus Gelen .. . . . . . . . . 53
2.4.1 Quantitative Elektroelution von Proteinen aus
Polyacrylamid-Gelen und Entfernung von SDS. 53
2.4.2 Elektrotransfer von Proteinen (Western blot) 54
2.4.3 Immunochemischer Antigennachweis nach
Elektrotransfer . . . . . . . . . . . . . . . . . 56
2.4.4 Glycoprotein-Detektion nach Elektrotransfer 57
2.4.5 Transfer von Nucleinsauren . . . . . 58
2.5 Trocknung von Elektrophoresegelen 60
2.6 Autoradiographie von 3H_ und 35S-markierten
Verbindungen in Elektrophoresegelen . . . .. 61
3 Chromatographische Methoden ........ 63
3.1 Diinnschichtchromatographie (DC) ....... 63
3.1.1 Diinnschichtchromatographie von modifizierten
Aminosauren (Bestimmung der N-terminalen
Aminosaure im Polypeptid) . . . . . . 63
3.1.2 Trennung von Nukleosidphosphaten . . . . .. 67
3.1.3 Lipidextraktion und Diinnschicht-
chromatographie von Lipiden. . . . . 69
3.2 Saulenchromatographie. . . . . . . . 71
3.2.1 Konzentrierung von Proteinlosungen . 71
3.2.2. Praktische Hinweise zur Saulenchromatographie 74
3.2.3 Vorbehandlung von Ionenaustauscher-
Materialien . . . . . . . . . 85
3.3 Affinitatschromatographie....... 87
3.3.1 Bromcyanaktivierung von Polysaccharid-
Chromatographietragern ........ 90
3.3.2 Kopplung an Bromcyan-aktivierte Gele . 91
3.3.3 Kopplung von Reaktivfarbstoffen an
Polysaccharide . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 93
X Inhaltsverzeichnis
3.3.4 Kovalente Bindung von Biotin
(Biotin-Avidin/Streptavidin-System) . . . . . .. 94
4 Immunchemische Methoden . 96
4.1 Heidelberger-Kurve . . . . . . 96
4.2 Doppelt-radiale Immunodiffusion nach
Ouchterlony .................... 98
4.3 Immunelektrophorese . . . .... 100
4.4 Gegenstromelektrophorese · 101
4.5 dot-blot-Test ....... . · 102
4.6 Enzym-Immunosorbent-Test (EIA bzw. ELISA) 103
4.7 Meerrettichperoxidase-Immunoglobulin-
Konjugat (Glutaraldehyd-Methode) . . . . 105
4.8 AIkalische-Phosphatase-Immunoglobulin-
Konjugat (Glutaraldehyd-Methode) 107
4.9 Protein-kolloidales-Gold-Komplex . . 109
5 Ultrazentrifugation . . . . 112
5.1 Differentialzentrifugation . 113
5.2 Dichtegradientenzentrifugation . 114
5.2.1 Stufengradientenzentrifugation. 116
5.2.2 Saccharosegradientenzentrifugation 117
5.2.3 Isopyknische Zentrifugation .... . 120
5.3 Drehzahl-Zentrifugalbeschleunigungs-
Nomogramme . . . . . . . . . . . . . . 125
6 Nukleinsaure-Sequenzanalyse (Y. Hahn) 127
6.1 DNS-Sequenzanalyse . . . . . . . . . 127
6.1.1 Chemisches Sequenzierungsverfahren
(Maxam-Gilbert-Verfahren) ..... . · 127
6.1.2 Enzymatisches Sequenzierungsverfahren
(Sanger-Technik), Prinzip der basenspezifisch
beendeten Synthese (Kettentermination) ..... 148
Inhaltsverzeichnis XI
6.2 RNS-Sequenzanalyse.. . . . 155
6.2.1 Markierung der RNS .... . 156
6.2.2 Sequenzierung der RNS mittels
basenspezifischer chemischer Spaltung . . 159
6.2.3 Sequenzierung durch basenspezifische
enzymatische Spaltung. . . . . . . . . . . 161
6.2.4 Basenspezifische chemische Spaltung von RNS
an einem Trager (Festphasen-Sequenzanalyse) . 163
7 Markierung mit radioaktiven Isotopen . 166
7.1 [32p]-Phosphatinkorporation in Proteine . 167
7.2 Iodierung mit 125I-Iodverbindungen . 169
7.3 Radioaktiver Zerfall . . . . . . . . . . 171
7.4 Zerfallstabellen fUr Phosphor-32, Schwefel-35
und Iod-125 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 172
7.5 Szintillator-Losungen fUr die
Flussigszintillati onsmessung . . 174
8 Puffersysteme und pH-Wert .......... 176
8.1 pk-Werte und Molmassen von Puffersubstanzen 176
8.2 Diagramm zur Pufferberechnung . . 177
8.3 pH-Farbindikatoren........ . 180
8.4 Nomogramm zur Herstellung von
Phosphatpuffem mit definierter Ionenstarke . 182
8.5 Pufferlosungen . 184
8.6 pH-Eichpuffer . 188
9 Reinigungsvorschriften filr ausgewahlte
Laborchemikalien. . . . . . . . . . . . .. . 190
10 Tabellen...... . 193
10.1 Konzentrationsma13e . . . . . 193
10.2 Umrechnung SI-fremder Ma13einheiten in
SI-Einheiten ................. . 193