Beeinflussung von Zellphysiologie und mitochondrialer Funktion durch Alzheimer Demenz ...

253 Pages·2016·37.54 MB·German

Beeinflussung von Zellphysiologie
und mitochondrialer Funktion durch
Alzheimer Demenz-assoziiertes
Amyloides-β Peptid

Vom Fachbereich Chemie
der Technischen Universität Darmstadt

zur Erlangung des akademischen Grades eines
Doctor rerum naturalium (Dr. rer. nat.)

genehmigte
Dissertation

vorgelegt von
Dipl.-Biochem. Victoria Decker
aus Dernbach

Referent: Prof. Dr. Norbert A. Dencher
Korreferent: PD Dr. Tobias Meckel
Tag der Einreichung: 06. April 2016
Tag der mündlichen Prüfung: 24. Oktober 2016

Darmstadt 2016

D17

Die vorliegende Arbeit wurde unter Leitung von Herrn Prof. Dr. Norbert A. Dencher in der
Zeit von März 2012 bis April 2016 am Clemens-Schöpf-Institut für Organische Chemie und
Biochemie des Fachbereichs Chemie der Technischen Universität Darmstadt angefertigt.

I

Teile der vorliegenden Arbeit wurden bereits auf Fachtagungen präsentiert:

06/2015 V. Decker, S. Kern, T. Meckel, N. A. Dencher
Mitochondrial membranes are the target of Alzheimer’s disease triggering
amyloid-β 1-42 (Aβ ) peptide (Poster 95)
1-42
Mechansims of Neurodegeneration, EMBL, Heidelberg

03/2015 V. Decker, T. Meckel, N. A. Dencher:
Interaction of Alzheimer’s disease triggering amyloid-β peptide with mammalian
mitochondria (Poster P9)
12. German Peptide Symposium, TU Darmstadt

10/2013 V. Decker, S. Eckes, N. A. Dencher:
Localization of amyloid-beta 1-42 (Aβ ) peptides in cells and their influence
1-42
on mitochondrial function (Pecha Kucha Talk PKV24 und Poster PKV24)
Molecular Life Sciences 2013, Goethe Universität, Frankfurt

04/2013 L. Cavlovic, V. Decker, M. Azakli, C. Kern, S. Kern, N. A. Dencher:
Functional and proteomic comparison of rat oligodendroglia cell line OLN-93
and human neuroblastoma cell line SH-SY5Y as model systems for the influence
of X-ray radiation and amyloid-beta peptides
(DOI®: 10.3288/contoo.paper.2593)
64. Mosbacher Kolloquium, Alte Mälzerei, Mosbach

Publikationen

2016 Manuskript in Präparation (geplante Veröffentlichung in PNAS)
V. Decker, S. Kern, T. Meckel, N. A. Dencher:
Alzheimer’s disease Aβ oligomers target endosomal and mitochondrial
1-42
membranes

2016 Manuskript in Präparation (geplante Veröffentlichung in J. Proteome Res.)
M. Kratochwil, S.-H. Marx, V. Decker, S. Hartwig, K. Kuter, L. Cavlovic,
K. Ossowska, S. Lehr, N. A. Dencher:
Identification of conserved mitochondrial proteins of tissues from several
mammalian hearts and rat brain areas as well as cell culture samples: proteome
analysis after protein separation by 2D-BN/SDS-PAGE

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© 2009 MetLife Foundation, New York (USA). PEANUTS © UFS, Inc.
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Inhaltsverzeichnis

1 Zusammenfassung ............................................................................................................... 1
1.1 Beeinflussung von Zellphysiologie und mitochondrialer Funktion durch
Alzheimer Demenz-assoziiertes Amyloides-β Peptid .................................................. 1
1.2 Alzheimer's disease triggering amyloid-β peptide alters cell physiology and
mitochondrial function ................................................................................................. 4
2 Einleitung .............................................................................................................................. 7
2.1 Demenzerkrankungen ................................................................................................... 7
2.2 Die Alzheimer Demenz ................................................................................................ 9
2.3 Das amyloide-β Peptid (Aβ) ....................................................................................... 11
2.3.1 Entstehung von Aβ Peptiden ...................................................................................... 11
2.3.2 Das Aβ Peptid........................................................................................................ 13
1-42
2.3.3 Neurotoxizität verschiedener Aβ Spezies .................................................................. 14
2.4 Zusammenspiel von Aβ Peptiden und tau Proteinen.................................................. 16
2.5 Mitochondrien ............................................................................................................ 17
2.5.1 Die oxidative Phosphorylierung................................................................................. 17
2.5.2 Das mitochondriale Membranpotenzial ..................................................................... 18
2.5.3 Reaktive Sauerstoffspezies ........................................................................................ 19
2.5.4 Apoptose .................................................................................................................... 20
2.6 Die Rolle der Mitochondrien bei Alzheimer Demenz................................................ 21
2.7 Motivation .................................................................................................................. 22
3 Materialien ......................................................................................................................... 25
3.1 Geräteliste ................................................................................................................... 25
3.2 Verbrauchsmaterialien................................................................................................ 28
3.3 Zelllinien .................................................................................................................... 30
3.3.1 OLN-93 ...................................................................................................................... 30
3.3.2 SH-SY5Y ................................................................................................................... 31
3.4 Chemikalienliste ......................................................................................................... 31
3.5 Zellkulturbedarf .......................................................................................................... 35
3.6 Proteinmassenstandards.............................................................................................. 35
3.7 Peptide ........................................................................................................................ 35
3.8 Plasmid ....................................................................................................................... 36
3.9 Antikörper .................................................................................................................. 36
3.9.1 Primäre Antikörper .................................................................................................... 36
3.9.2 Sekundäre Antikörper ................................................................................................ 36
3.10 Gase ............................................................................................................................ 36
3.11 Kits ............................................................................................................................. 37
3.12 Puffer und Lösungen .................................................................................................. 37
3.13 Stammlösungen .......................................................................................................... 40
3.14 Medien und Puffer für die Zellkultur ......................................................................... 41
3.15 Software...................................................................................................................... 42
Inhaltsverzeichnis VII
4 Methoden ............................................................................................................................. 43
4.1 Kultivierung adhärenter Zelllinien .............................................................................. 43
4.2 Subkultivierung adhärenter Zelllinien ........................................................................ 43
4.3 Bestimmung der Zellzahl ............................................................................................ 43
4.4 Kryokonservierung ..................................................................................................... 44
4.5 Bestimmung der Populationsverdopplungszeit .......................................................... 45
4.6 Generierung einer stabilen Zelllinie ........................................................................... 45
4.7 Disaggregation von Aβ Peptiden ................................................................................ 46
4.8 Applikation von Aβ Peptiden ..................................................................................... 46
4.9 Nachweis von extern applizierten Aβ Peptiden .......................................................... 46
4.10 Zellviabilitätstests ....................................................................................................... 47
4.10.1 Neutralrot-Aufnahmetest ........................................................................................... 47
4.10.2 AlamarBlue® Test .................................................................................................... 47
4.10.3 Annexin V/Propidiumiodid Test ............................................................................... 48
4.11 Nachweis Reaktiver Sauerstoffspezies ....................................................................... 49
4.12 Bestimmung des mitochondrialen Membranpotenzials .............................................. 50
4.12.1 JC-1 Test ................................................................................................................... 50
4.12.2 MitoTracker® Test .................................................................................................... 51
4.13 Durchflusszytometrie .................................................................................................. 51
4.14 Konfokalmikroskopie ................................................................................................. 53
4.15 Generierung von Zelllysaten ....................................................................................... 55
4.16 Isolierung von Mitochondrien .................................................................................... 55
4.16.1 Isolierung von Mitochondrien für gelbasierte Methoden .......................................... 55
4.16.2 Isolierung von Mitochondrien für in-Lösung Aktivitätstests .................................... 56
4.17 Proteinbestimmung nach Bradford ............................................................................. 56
4.18 Bestimmung der Adenosintriphosphat (ATP) Konzentration .................................... 57
4.19 Fluoreszenzanisotropie ............................................................................................... 58
4.20 Solubilisierung von Membranproteinen ..................................................................... 59
4.20.1 Solubilisierung von Membranproteinen aus Rinderherzmitochondrien (BHM) ....... 60
4.20.2 Solubilisierung von Membranproteinen aus Zellkulturen ......................................... 60
4.21 Polyacrylamidgelelektrophorese (PAGE) ................................................................... 61
4.21.1 SDS-PAGE ................................................................................................................ 61
4.21.2 Blau-native (BN) PAGE ............................................................................................ 63
4.21.3 2D-BN/SDS-PAGE ................................................................................................... 65
4.22 Aktivitätstests für OxPhos Komplexe......................................................................... 66
4.22.1 In-Gel Aktivitätstests................................................................................................. 66
4.22.1.1 Quantitativer in-Gel Aktivitätstest für OxPhos Komplex I bzw. IV ...................... 67
4.22.1.2 Qualitativer in-Gel Hydrolyseaktivitätstest für OxPhos Komplex V ..................... 70
4.22.2 In-Lösung Aktivitätstests .......................................................................................... 71
4.22.2.1 Quantitativer in-Lösung Aktivitätstest für OxPhos Komplex I .............................. 72
4.22.2.2 Quantitativer in-Lösung Aktivitätstest für OxPhos Komplex II ............................ 73
4.22.2.3 Quantitativer in-Lösung Aktivitätstest für OxPhos Komplex IV ........................... 74
4.22.2.4 Quantitativer in-Lösung Aktivitätstest für Citrat-Synthase.................................... 74
4.22.3 Aktivitätstest mit immobilisiertem OxPhos Komplex I ............................................ 75
4.23 Western Blot ............................................................................................................... 76
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