Avaliação do estresse oxidativo em ilhotas pancreáticas humanas e em cultura de células INS-1E

167 Pages·2007·4.96 MB·Portuguese

UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
INSTITUTO DE QUÍMICA
Programa de Pós-Graduação em Bioquímica

ADRIANA MIRANDA CARVALHO

Avaliação do estresse oxidativo em
ilhotas pancreáticas humanas e em
cultura de células INS-1E

São Paulo
Data do depósito do trabalho na SPG: 22/02/2007
Vinte e dois de fevereiro de dois mil e sete
ADRIANA MIRANDA CARVALHO

Avaliação do estresse oxidativo em
ilhotas pancreáticas humanas e em
cultura de células INS-1E

Tese apresentada ao Instituto de Química da
Universidade de São Paulo para obtenção do
título de Doutor em Bioquímica.

Orientador: Prof. Dr. Pio Colepicolo Neto

São Paulo
Data do depósito do trabalho na SPG: 22/02/2007
Vinte e dois de fevereiro de dois mil e sete
Aos meus pais Rosa e Albino, pelo amor incondicional e esforço
que sempre fizeram para que eu chegasse até aqui. Por
compreenderem minha ausência em vários momentos...

Ao Guga, Rafifa e Pacotinho, por tornarem minha vida muito
mais feliz.

Aos meus irmãos Marcelo e Fátima, pelos ótimos momentos que
curtimos até aqui e pelos muitos que ainda virão.
Vocês são presentes de Deus, minha referência de vida e
inteligência.

Ao Sérgio, meu amor, pelo incansável apoio experimental e
emocional! Você foi fundamental desde o início até aqui. Obrigada
por sempre acreditar no meu sucesso!
Agradecimentos

Muitas pessoas participaram direta ou indiretamente da realização deste
trabalho, mas a algumas devo considerações especiais:
Ao Prof. Dr. Pio Colepicolo Neto, pela orientação, amizade e apoio que
sempre demonstrou durante todo o período de trabalho e ainda, por me mostrar a
importância deste projeto.
À Dra. Mari Cleide Sogayar, que embora não esteja como co-orientadora
oficial deste projeto, sempre esteve presente nas discussões. Obrigada pela
atenção, apoio e ainda, por disponibilizar gentilmente seus laboratórios (Unidade
de Ilhotas Pancreáticas Humanas-USP e Laboratório de Biologia Celular e
Molecular) em muitas etapas deste trabalho.
À Dra. Ligia Ferreira Gomes e Dra. Virginia B. C. Junqueira, pelos
ensinamentos e amadurecimento científico no início da minha carreira
profissional.
À sempre amiga Dra. Silvya Stuchi Maria-Engler pelo incentivo no início
deste trabalho.
Às Pioloketes, com quem tive o prazer de conviver nestes anos de trabalho:
Angela Tonon, pelas conversas e momentos divertidíssimos;
Karina Helena Moraes Cardozo, peja ajuda nos experimentos de MDA e
glutationação e ainda, pelas conversas que tanto contribuíram para o crescimento
pessoal e profissional;
Thais Guaratini, pelo carinho, conversas e por estar sempre disposta a
tudo para ajudar. Por me mostrar que nada é impossível!
Vanessa dos Reis Falcão, por ser assim, a “Vanessão”, que atrás desse
jeito às vezes durão tem sempre uma palavra de apoio e entusiasmo;
À grande amiga Dra. Antonietta Leitão, pelas conversas enriquecedoras
tanto pessoal quanto profissional e por estar sempre por perto, por mais distante
que estivéssemos.
Ao Ednailson Pereira de Carvalho, pela grande amizade e auxílio técnico
durante os experimentos (principalmente com animais!) e por estar sempre ao
meu lado em todos os momentos da realização desta tese.
Aos companheiros do laboratório: Ana, Anderson, Moacir, Sara, Ernani,
Douglas, Fabyana, Humberto, Lígia, Maísa, Marcelo, Meron, Paula, Sidney e
Teresa pela amizade e bons momentos.
À Sandra Regina, pelas conversas, disposição para ajudar e ainda, por
manter nosso laboratório em condições apropriadas para o trabalho.
Ao amigo Eduardo Costa Ramos (Dudu), pelo companheirismo diário e
pelas inúmeras conversas e reflexões.
Ao amigo Stefano Pashalidis, sempre com uma palavra amiga e
motivadora.
Aos amigos Thiago e Elizabeth Oliveira, pelas horas de alegria e pela
ajuda, em diferentes épocas, nos experimentos iniciais de isolamento de ilhotas de
ratos.
Ao Luis Fernando Otalora, o peruano mais brasileiro que já conheci.
Obrigada pelos excelentes momentos de convivência.
Ao amigo Marcus Demasi, pelas dicas nos experimentos e pelas agradáveis
conversas.
Ao Prof. Dr. Fernando Nogueira, pela amizade e apoio pessoal e
profissional.
À Flávia Vigna, por estar sempre por perto.
A todos da Secretaria de Pós Graduação do IQ-USP pela sempre dedicação
e boa vontade em realizar os serviços prestados.
Apoio Financeiro

FAPESP - Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de São Paulo
CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientifico e Tecnológico
FINEP - Financiadora de Estudos e Projetos
ICGEB - International Centre for Genetic Engineering and Biotechnology
PRP-USP - Pró Reitoria de Pesquisa – USP
PRPG-USP - Pró Reitoria de Pós- Graduação – USP
Sumário
Sumário

LISTA DE FIGURAS ..............................................................................................7
LISTA DE TABELAS..............................................................................................9
RESUMO.................................................................................................................10
ABSTRACT.............................................................................................................12
LISTA DE ABREVIATURAS...............................................................................17
1. INTRODUÇÃO...................................................................................................19
1.1- Diabetes mellitus: breve histórico.........................................................................19
1.2- Diabetes mellitus: a doença...................................................................................24
1.3- Terapêuticas..........................................................................................................31
1.4- Ilhotas pancreáticas e o estresse oxidativo...........................................................41
2. OBJETIVOS.......................................................................................................55
3. MATERIAL E MÉTODOS................................................................................57
3.1- Ilhotas Pancreáticas Humanas*...........................................................................57
3.2- Estudo da toxicidade da polissacarose em células INS-1E.................................63
3.3- Efeito da N-acetilcisteína (NAC) em células INS-1E...........................................73
3.4- Análise estatística..................................................................................................75
4. RESULTADOS...................................................................................................77
4.1- Determinação da atividade de SOD e catalase e dos níveis de proteína oxidada
.......................................................................................................................................77
4.2- Curva de Crescimento de células INS-1E.............................................................94
4.3- Análise microscópica de células expostas a polissacarose...................................97
4.4- Danos oxidativos em células INS-1E expostas à polissacarose...........................99
4.5- Atividade de enzimas antioxidantes de células INS-1E expostas a polissacarose
.....................................................................................................................................101
4.6- Determinação de GSH e GSSG...........................................................................103
4.7- Efeito da polissacarose na viabilidade e nos níveis protéicos de p38, JNK-1, ERK
1-2 e PI3K de células INS-1E expostas à polissacarose............................................108
4.8- Efeito da NAC em cultura de células INS-1E....................................................110
5. DISCUSSÃO.....................................................................................................120
6. CONCLUSÕES.................................................................................................143
7. ANEXO..............................................................................................................146
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS...........................................................148
CURRICULUM VITAE........................................................................................166
Lista de Figuras
Figura 1. Morfologia de uma ilhota de Langerhans no pâncreas: células alfa, beta
e delta envoltas por ácinos pancreáticos e vasos sangüíneos .........................25
Figura 2. Consequências metabólicas da deficiência persistente de insulina
(Adaptado de Davies et al., 2001).....................................................................27
Figura 3. Principais etapas do processo de isolamento de ilhotas pancreáticas a
partir de um pâncreas humano doado.............................................................35
Figura 4. Transplante de ilhotas humanas purificadas.........................................36
Figura 5. Ilhotas pancreáticas humanas coradas com DTZ...................................60
Figura 6. Reação entre TBA e MDA........................................................................69
Figura 7. Estrutura molecular do sal dicloreto de N,N´-dimetil-4,4´-dipiridínio
(paraquat)..........................................................................................................73
Figura 8. Esquema de protocolo simplificado mostrando as etapas de coleta das
amostras durante o processo de isolamento/purificação e cultivo de ilhotas
pancreáticas humanas......................................................................................78
Figura 9. Resultado das análises do pâncreas P13/01...........................................80
Figura 10. Resultado das análises do pâncreas P14/01.........................................82
Figura 11. Resultado das análises do pâncreas P15/01.........................................84
Figura 12. Resultado das análises do pâncreas P16/01.........................................85
Figura 13. Resultado das análises do pâncreas P20/01.........................................87
Figura 14. Resultado das análises do pâncreas P21/01.........................................89