ATP/ADP/AMP metabolism and aging in Caenorhabditis elegans

124 Pages·2011·11.37 MB·Dutch

FACULTY OF SCIENCES
DEPARTMENT OF BIOLOGY
RESEARCH GROUP AGING PHYSIOLOGY AND MOLECULAR EVOLUTION

Academic year 2010 - 2011

ATP/ADP/AMP metabolism and aging
in Caenorhabditis elegans

Arne SMOLDERS

Supervisor: Prof. Dr. Bart P. Braeckman
Mentor: Dr. Filip Matthijssens
Thesis submitted to obtain the
degree of Master in Biology
Age is an issue of mind over matter.
If you don't mind, it doesn't matter.
Mark Twain
Acknowledgements
During the past 12 months this research overwhelmed my daily thoughts while worms were figuring in
many dreams. More than once I was told I was cruel because I liquidated ‘mother worms bearing
babies’. However, I argued doing so for a higher purpose: delivering a thesis and hopefully
contributing to the knowledge about aging Caenorhabditis elegans. Nonetheless, I had a remarkable
time at the lab, I learned lots of things, I got to know nice people and had frustrating ánd proud
moments sitting behind my computer. After all it was an unforgettable year (in the good way)!
Obviously, you would not be reading this without the opportunity given to me by several scientists.
First of all I am very grateful to my supervisor, Prof. Dr. Bart P. Braeckman, for giving me the
possibility and the resources to conduct fascinating research at his lab. He inspired me considerably
during the last three years with his enthusiastic way of teaching, interesting topics, exciting stories,
challenging examinations and his motivating personality.
The lab and therefore also this thesis would not exist without the decades of efforts in research and
building up of this well equipped lab by Prof. Dr. Jacques Vanfleteren, to whom I therefore express
my gratitude.
Obviously, my thesis would be nothing alike without my outstanding mentor Dr. Filip Matthijssens.
He ‘masterminded’ the topic and goals, explained me how each instrument that crossed our sight
operates, guided me intensively, encouraged me to think of and to perform experiments autonomously,
assisted me in interpreting data, corrected and improved my thesis draft versions, astonished me with
his seemingly endless theoretical and practical knowledge and pleasured me by jointly reasoning,
discussing and thinking of solutions, possibilities and opportunities. And all this taking place with a
great sense of humour. Thank you Filip!
Further I would like to thank (in random order) all the persons that contributed to this master thesis
while working in a pleasant atmosphere (surrounded by millions of worms, as my two old aunts
imagine the place).
Renata: For possibly saving my life a few times by making me aware of the hidden dangers of many
chemicals, for executing a lot of preparatory work for my experiments, for learning me the importance
of working absolutely sterile, for the nice chats and of course for the delicious ice cream with
strawberries and chocolate sauce!
Patricia: For teaching me, with her experience in biosensors, to process the images of Perceval
transgenic worms, giving me tips and tricks in experimental as well as data-managing techniques,
rescuing experiments in weekends and of course the pleasant conversations.
Geert: I really got to know Geert when he sabotaged my first experiments by throwing my wild-type
juveniles in the trash after he begged to use a few of them. Or, more likely, this ‘sad’ incident was just
a consequence of his laborynthic mind full of hypotheses. After all, he really rectified this by feeding
my worms several weekends, by giving me interesting insights and hints and by having amusing
discussions.
Ineke: For teaching me the possibilities of confocal laser scanning microscopy, for showing me how
to process the resulting images and sharing her experience to deliver a good thesis.
Sasha: For giving me a lot of practical advice concerning nematode phenotypes and culturing, helping
me out with experiments during weekends when I could not make it to the lab and assisting me in
planning the time schedule for the delivery of the thesis.
Nilesh: For teaching me a regional Indian language (episode 1.1.1), improving my spoken English at
many occasions, learning me interesting intercultural differences and having funny talks.
Natascha: For giving me tips and tricks about culturing techniques, for sharing ‘metabolic’ knowledge
and alerting me for the dangers of working with cyanide.
Andy: For sequencing the expression plasmids, troubleshooting me during technical and computer-
related issues and, of course, joking around.
Caroline: For making it possible for me to get and find everything I needed for my experiments, for
keeping an eye on the autoclave and for organizing a nice quiz (with some dubious arbitral decisions),
a dinner and an ice skating trip with the ‘aging’ group which facilitated my integration in the team.
Marjolein: For executing the microinjection several times successfully.
Kristel: For introducing me in the fabulous world of Caenorhabditis elegans and its aging during my
bachelor thesis and teaching me a dozen of techniques that gave me a significant advantage during this
master thesis.
I especially want to thank my mom and dad for giving me the opportunity to start and finish these
higher studies in the best circumstances. They supported and motivated me endlessly, while
encouraging me to explain the world of aging C. elegans in easy words to a non-scientific audience.
Thanks to the many interesting talks and discussions with my parents and my brother Siemen I am
now rewarded with a questioning and critical mind which is indispensable in this area of expertise.
Moreover, I am very grateful for the many fine moments we shared this year.
I also want to express my gratitude to both my lovely aunts (Charline and Alice) for their limitless
support and encouragements and for all the good care I received my entire life.
Ik wil ook mijn dank uiten aan mijn fantastische “tantjes”, tante Charline en tante Alice, die me altijd
gesteund en aangemoedigd hebben. Bedankt voor de verwennerij, goede zorgen en vele leuke en
gezellige momenten dit en de voorbije 20 jaar.
I also want to thank someone very special to me, my girlfriend Nathalie. She really motivated and
stimulated me this year. When experiments failed she was there to support me and encourage me to be
resilient. She was able to get my head out of the world of worms and gave me mental rest when I
needed it most. I could also share my happiness with her when I discovered something interesting. At
last, she was responsible for most of the (non-research-related) pretty and funny moments the past
year. Thank you Nathalie!
Finally, thank you, dear reader, for your interest in this master thesis.

Arne
Table of contents
1 Samenvatting ................................................................................................................................. 1
2 Introduction ................................................................................................................................... 7
2.1 Aging ....................................................................................................................................... 7
2.2 The model organism Caenorhabditis elegans ....................................................................... 11
2.2.1 Ecology of C. elegans.................................................................................................... 13
2.2.2 Morphology and Anatomy of C. elegans ...................................................................... 13
2.2.3 Life cycle of C. elegans ................................................................................................. 17
2.2.4 Insulin/IGF-1 pathway in C. elegans ............................................................................. 20
2.3 Adenine nucleotides .............................................................................................................. 28
2.3.1 ADP/ATP and AMP/ATP ratios ................................................................................... 28
2.3.2 Control of energy level .................................................................................................. 29
2.3.3 Energy charge ................................................................................................................ 29
2.3.4 Aging and adenine nucleotides ...................................................................................... 30
2.3.5 AMPK as energy sensor ................................................................................................ 32
2.4 Perceval: a fluorescent reporter of ADP/ATP ratio ............................................................... 39
2.4.1 ATP detection ................................................................................................................ 39
2.4.2 Perceval ......................................................................................................................... 39
3 Goals and experimental outline .................................................................................................. 43
4 Materials and methods ................................................................................................................ 44
4.1 C. elegans culture .................................................................................................................. 44
4.1.1 Used strains ................................................................................................................... 44
4.1.2 Freezing and thawing strains ......................................................................................... 45
4.1.3 Agar plates ..................................................................................................................... 46
4.1.4 Escherichia coli ............................................................................................................. 47
4.1.5 Setting up synchronized aging C. elegans cohorts ........................................................ 48
4.1.6 Sampling ........................................................................................................................ 50
4.2 HPLC-fluorometric assay ...................................................................................................... 51
4.2.1 Formation of fluorescent derivatives ............................................................................. 51
4.2.2 RP-HPLC analysis ......................................................................................................... 52
4.2.3 BCA assay for protein quantification ............................................................................ 55
4.3 Perceval: proof of concept ..................................................................................................... 56
4.3.1 Molecular cloning techniques ........................................................................................ 56
4.3.2 Transformation of C . elegans by microinjection .......................................................... 64
4.3.3 Biolistic transformation of C. elegans ........................................................................... 66
4.3.4 Measuring ATP/ADP ratios in vivo with Perceval upon sodium azide treatment ......... 73
5 Results .......................................................................................................................................... 75
5.1 HPLC-fluorometric assay ...................................................................................................... 75
5.1.1 Chromatograms ............................................................................................................. 75
5.1.2 Absolute concentrations of adenine nucleotides ........................................................... 79
5.1.3 Indexes of cellular energy ............................................................................................. 84
5.1.4 Effect of culture and sampling method on energy indexes ........................................... 87
5.2 Proof of concept: Perceval reports ADP/ATP ratio in C. elegans ......................................... 88
5.2.1 Obtaining Perceval transgenic C. elegans ..................................................................... 88
5.2.2 Sodium azide treatment of Perceval transgenic worms ................................................. 93
6 Discussion ..................................................................................................................................... 98
6.1 HPLC-fluorometric assay ...................................................................................................... 98
6.1.1 Evaluation of the assay .................................................................................................. 98
6.1.2 Aging daf-2 mutants maintain high energy levels ....................................................... 100
6.2 Proof of concept: Perceval reports ADP/ATP ratio in C. elegans ....................................... 104
6.2.1 Obtaining Perceval transgenic C. elegans ................................................................... 104
6.2.2 Sodium azide treatment of Perceval transgenic C. elegans ......................................... 105
7 Conclusion .................................................................................................................................. 107
8 References .................................................................................................................................. 108
Summary

1 Samenvatting
Veroudering heeft een belangrijke impact op onze samenleving. De voorbije decennia is de
wetenschappelijke wereld geïntrigeerd geraakt door dit zeer complexe biologisch fenomeen. Een
belangrijk doel bij het onderzoek naar veroudering is het vertragen van dit proces. Zo zou men
ouderdomsgerelateerde aandoeningen kunnen uitstellen en dus de levenskwaliteit op hogere leeftijd
significant verbeteren. Vanuit economisch standpunt zou dit een belangrijke stap zijn bij het oplossen
van de vergrijzingsproblematiek.
De voorbije 20 jaar lag moleculaire genetica aan de basis van enkele belangrijke doorbraken. Eén
daarvan is de ontdekking dat de levensduur sterk verlengd kan worden door één enkel specifiek gen uit
te schakelen. In het modelorganisme Caenorhabditis elegans vond men dat de levensduur verdubbeld
kan worden via een mutatie in het daf-2 gen dat codeert voor de insuline/IGF-1 receptor. De
daaruitvolgende verminderde activiteit van de insuline/IFG-1 signaalcascade is via verschillende, nog
niet volledig gekende mechanismen verantwoordelijk voor de levensduurverlenging. Opmerkelijk is
dat dit eerder gepaard gaat met een langere vitale periode dan met een langere aftakeling. Een
veranderd energiemetabolisme zou hierbij een niet te onderschatten rol kunnen spelen.
Het doel van dit onderzoek is tweeledig en omvat een toename in de kennis omtrend de relatie tussen
energiemetabolisme en veroudering in Caenorhabditis elegans.
1. Er werd getracht om een completer beeld te verkrijgen van de dynamiek van ATP, ADP en
AMP in zowel verouderende wildtype wormen als in langlevende daf-2 mutanten. Door
verschillende indicatoren van cellulaire energieniveaus te bepalen waren we in staat een
mogelijk mechanisme voor te stellen dat de energietoestand koppelt aan het
verouderingsproces.
2. De genetisch gecodeerde fluorescente sensor ‘Perceval’ maakt het mogelijk om intracellulaire
ADP/ATP ratios in vivo en in real time te detecteren in zoogdiercellen. In dit deel van het
onderzoek werd Perceval tot expressie gebracht in C. elegans en gingen we na of deze sensor
bruikbaar is als indicator van cellulaire energie in intacte C. elegans wormen.

Om de dynamiek van ATP, ADP en AMP in kaart te brengen, was het vooreerst belangrijk grote
synchrone populaties van wormen (zowel wildtype als daf-2 mutanten) op te kweken. Zo konden we
voor elke leeftijd enkele wormstalen nemen. De wormen werden gehomogeniseerd en de aanwezige
adenine nucleotiden gederivatizeerd tot fluorescente etheno(ε)-adenine nucleotiden.

1
Summary
Deze adenine nucleotidederivaten werden vervolgens gescheiden door middel van reverse-phase high-
performance liquid chromatography (RP-HPLC). Fluorescentiedetectie van de gescheiden ε-ATP, ε-
ADP en ε-AMP en het gebruik van standaarden lieten toe om exacte oorspronkelijke concentraties van
ATP, ADP en AMP in de wormstalen te berekenen. Uiteindelijk werden nog verschillende indicatoren
voor cellulaire energieniveaus (AMP/ATP ratio, ADP/ATP ratio en de ‘energy charge’) berekend.
Uit de resultaten werd geconcludeerd dat, in tegenstelling tot wildtype wormen, langlevende daf-2
mutanten in staat zijn om tijdens het verouderen hogere cellulaire concentraties van zowel ATP als
ADP te behouden. We vermoeden dat dit het gevolg is van verhoging van AAK-2 activiteit door
verminderde inhiberende insuline/IGF-1 signaaloverdracht in deze insuline/IGF-1 receptor mutant.
AAK-2 maakt deel uit van een enzymcomplex (AMPK) dat energieniveaus integreert en metabole en
transcriptionele veranderingen reguleert om energetische homeostase te bereiken. Sterkere AAK-2
activering leidt tot ATP productie, kan de levensduur verlengen en verhoogt de activiteit van
autofagie. Dit laatste zou belangrijk kunnen zijn om hoge energieniveaus te behouden en die kunnen
geïnvesteerd worden in onderhoud van de cellulaire functies en in levensduurverlenging.

Omdat cellulaire ATP concentraties geen volledige weergave bieden van de energietoestand van een
cel, werd recent een genetisch gecodeerde reporter van ADP/ATP ratios, Perceval, ontwikkeld en
getest zowel in vitro als in een celcultuur. Perceval bindt ATP en ADP met een verschillende affiniteit
en andere fluorescentierepons tot gevolg. Het in interessant om na te gaan of deze biosensor ook
bruikbaar is om energieniveaus in levende Caenorhabditis elegans wormen in ‘real-time’ te meten.
In een eerste stap werd het gen Perceval, via Gateway® klonering, gekoppeld aan verschillende
promoters die constitutief tot expressie komen in de meeste weefsels van C. elegans. Vervolgens
werden verschillende moleculaire kloneringsstappen uitgevoerd om tot plasmiden (expressievectoren)
te komen die het gen Perceval in de juiste conformatie bevatten om expressie in C. elegans te
bekomen.
Zeven constructen bestaande uit onder andere Perceval in combinatie met een verschillende promoter.
werden in de gonaden van verschillende C. elegans hermafrodieten gebracht via microinjectie. Het
daaruitvolgende nageslacht bracht slechts één getransformeerde fluorescente worm voort. In de
volgende generaties werd mozaïek expressie en een gradueel verlies van Perceval opgemerkt, het
gevolg van de aanwezigheid van de plasmiden als grote extrachromosomale ‘arrays’
(aaneengeschakelde plasmiden). Via UV-bestraling werd, tevergeefs, getracht om de constructen in
het genoom te integreren. Wormen waarbij Perceval sterk geëxpresseerd wordt in het nageslacht
werden geselecteerd en verder opgekweekt.

2
Summary
Stabiele integratie van Perceval in het genoom is belangrijk om ten volle gebruik te kunnen maken
van de mogelijkheden die Perceval biedt. Daarom werden wormen ook getransformeerd via
biolistische transformatie. Hierbij werden ruim een half miljoen wormen gebombardeerd met
goudpartikels. Aan deze goudpartikels werden lineare plasmiden, van het construct dat tot expressie
kwam via microinjectie, gebonden die vervolgens konden integreren in the chromosomen. Hoewel
transformanten verkregen werden, kwam Perceval hier niet tot expressie. Mogelijks is dit het gevolg
van ‘silencing’ door integratie van het construct in heterochromatine waar geen transcriptie
plaatsvindt.
Uiteindelijk werd een grote populatie van fluorescente Perceval-transgene wormen opgekweekt
vertrekkende van een niet-geïntegreerde lijn. Via fluorometrie werd nagegaan of een verandering in
fluorescentierespons van Perceval kan worden waargenomen na inhibitie van mitochondriale respiratie
door natrium azide. We stelden vast dat de fluorescentierespons zeer snel en drastisch veranderde. Dit
bewijst dat het mogelijk is Perceval te gebruiken om veranderingen in de ADP/ATP ratio in ‘real-
time’ en op een niet-invasieve manier te detecteren in levende Caenorhabditis elegans wormen.
Bij een ander experiment werd gebruik gemaakt van confocale laserfluorescentiemicroscopie. Er
werden foto’s getrokken van individuele Perceval-transgene wormen, zowel voor als na het toedienen
van natriumazide. De foto’s werden bewerkt om een beeld te krijgen van weefselspecifieke
expressiepatronen en weefselspecifieke verschillen in fluorescentierespons van Perceval. Hierbij werd
enerzijds geobserveerd dat Perceval sterk tot expressie komt in de verwachte weefsels en anderzijds
dat er tussen verschillende weefsels duidelijke verschillen zijn in fluorescentierespons van Perceval.
Hieruit kon geconcludeerd worden dat met behulp can confocale laserfluorescentiemicroscopie
Perceval gebruikt kan worden voor het rapporteren van weefselspecifieke veranderingen in de
ADP/ATP ratio, een belangrijke indicator van cellulaire energieniveaus.

3