Arguments en faveur de l'existence d'une activité pro-apoptotique des lamellarines vis-à-vis des

264 Pages·2017·5.37 MB·French

by  Caroline Ballot

Arguments en faveur de l’existence d’une activité
pro-apoptotique des lamellarines vis-à-vis des cellules
tumorales par ciblage mitochondrial
Caroline Ballot
To cite this version:
Caroline Ballot. Arguments en faveur de l’existence d’une activité pro-apoptotique des lamellarines
vis-à-vis des cellules tumorales par ciblage mitochondrial. Biologie cellulaire. Université du Droit et
de la Santé - Lille II, 2009. Français. ￿NNT: ￿. ￿tel-00440821￿
HAL Id: tel-00440821
https://theses.hal.science/tel-00440821
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Université du Droit et de la Santé – Lille 2
THESE
Présentée pour l’obtention du grade de
DOCTEUR DE L’UNIVERSITE DE LILLE 2
Discipline Biologie Cellulaire
Par
Caroline BALLOT
Le 30 octobre 2009.
ARGUMENTS EN FAVEUR DE L’EXISTENCE D’UNE
ACTIVITE PRO-APOPTOTIQUE DES LAMELLARINES
VIS-A-VIS DES CELLULES TUMORALES PAR CIBLAGE
MITOCHONDRIAL.
Membres du jury :
Professeur Pierre FORMSTECHER
Docteur Bertrand JOSEPH (rapporteur)
Docteur Olivier SORDET (rapporteur)
Docteur Christian BAILLY (examinateur)
Directeur de thèse : Professeur Philippe MARCHETTI.
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Je tiens à exprimer ma plus grande reconnaissance au Docteur Joseph et au Docteur
Sordet pour avoir accepté d’être rapporteurs de ma thèse. Je remercie le Docteur Bailly de me
faire l’honneur de siéger dans ce jury.
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REMERCIEMENTS.
Je tiens tout d’abord à remercier Monsieur le Professeur FORMSTECHER, Directeur du
Centre de Recherche Jean-Pierre Aubert, pour m’avoir accueillie au sein de son équipe « Ciblage
moléculaire et cellulaire pour le traitement des Cancers ».
Je souhaite remercier tout particulièrement Monsieur le Professeur Philippe MARCHETTI,
pour son aide, ses conseils avisés et ses encouragements durant ces quatre années. Je te suis très
reconnaissante de la confiance que tu m’as accordée depuis mon arrivée dans ton équipe, de ton écoute
et de ton soutien face aux différentes épreuves. Merci pour m’avoir tant appris et fait découvrir une
partie de la biologie et de la physiologie des mitochondries. Expérience passionnante ! Je te remercie
également de m’avoir permise de réaliser le monitorat et un Mastère spécialisé en Drug Design.
Je remercie également les thésards, post-doctorants et étudiants que j’ai eu la chance de
côtoyer durant ma thèse : Jérôme, Manel, Miguel, Alain, Thomas, Khaled, Sébastien, Malika, Hélène,
Yasmine, Magali, Paul, Gaëlle. Sans oublier les « amis du 5ème ». Merci pour votre bonne humeur et
votre soutien.
Je ne voudrais oublier de mentionner ceux qui dans l’équipe n’ont jamais hésité à m’aider :
Anne-Sophie, Edith, Florence, Michèle, le Docteur Carole Marchetti, le Docteur Claude Méreau, le
Docteur Laurent Mortier, le Docteur Amélie Lansiaux, le Docteur Renata Polakowska, le Docteur
Marie-Hélène David. Merci à l’ensemble de l’équipe 4.
Je remercie mes amis pour leur présence et leur compréhension : la science du vivant impose
certaines contraintes temporelles et parfois un timing hors du commun !
Merci Aurélien pour ta présence, ta patience, ta compréhension et ton soutien.
Toute ma reconnaissance et mes plus grands remerciements s’adressent à mes parents et
Mathilde pour leur patience, leur confiance en moi et leur inconditionnel soutien. Merci de votre
présence sans faille à mes côtés dans cette aventure de la thèse.
A François, la vie ne nous a pas laissé le temps de
partager nos passions et nos projets.
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RESUME.
La plupart des traitements anticancéreux induisent l’apoptose des cellules tumorales in
vitro comme in vivo. Les agents anticancéreux classiques agissent au niveau de cibles
primitives, principalement localisées au niveau nucléaire, et activent consécutivement les
différentes voies apoptotiques conduisant au stade ultime à la mort des cellules. Cependant, la
résistance à l’induction de l’apoptose par les agents chimiothérapeutiques classiques reste un
problème crucial. De nouvelles approches ont été développées pour dépasser la résistance à
l’apoptose. Parmi elles, le ciblage de la mitochondrie apparaît comme une stratégie
prometteuse pour tuer les cellules cancéreuses résistantes. Ainsi, de nouvelles molécules
ciblant la mitochondrie ont été identifiées. Parmi celles-ci, notre laboratoire s’est intéressé aux
Lamellarines, alcaloïdes pyrroliques hexacycliques d’origine marine. Outre leur effet
inhibiteur des topoisomérases-I nucléaires, elles agissent également sur les mitochondries des
cellules cancéreuses.
Mon travail a consisté 1) à évaluer l’avantage des Lamellarines dans le traitement de
lignées de cellules cancéreuses résistantes, défaillantes dans les voies apoptotiques (cas des
carcinomes pulmonaires non à petites cellules, NSCLC) et 2) à décrypter les voies
apoptotiques déclenchées par les Lamellarines. Ainsi, 1) sur les cellules NSCLC hautement
résistantes à l’apoptose induite par les chimiothérapies classiques, nous avons évalué deux
agents anticancéreux potentiels de la famille des Lamellarines. La Lamellarine-D (Lam-D) et
son dérivé de synthèse, le PM031379, agissent directement sur la mitochondrie, induisant
l’activation de Bax, la libération mitochondriale de cytochrome-c et d’AIF et l’activation de la
caspase-3. Cependant, seul le PM031379 induit la mort cellulaire qui s’accompagne de la
translocation nucléaire d’AIF. De plus, cet effet létal nécessite la production d’espèces
réactives de l’oxygène (ROS) d’origine exclusivement mitochondriale. Ces résultats ont
permis de comprendre les mécanismes permettant de restaurer l’apoptose des cellules
chimiorésistantes. 2) La seconde partie de ce travail a consisté à caractériser les voies
apoptotiques déclenchées par la Lam-D en évaluant précisément le rôle du noyau et des
mitochondries dans son effet pro-apoptotique. La Lam-D exerce une remarquable cytotoxicité
envers un large panel de tumeurs. A des concentrations de l’ordre du micromolaire, elle
provoque l’apoptose nucléaire dans les cellules leucémiques sans blocage du cycle cellulaire.
Les signaux transmis par la Lam-D initient l’apoptose via la voie apoptotique intrinsèque
mitochondriale, activant Bax et réduisant les taux des protéines anti-apoptotiques Bcl-2 et
cIAP2, en association avec l’activation des caspases-9 et -3. Nos résultats ont également
permis d’évincer l’implication de la voie apoptotique extrinsèque dans la mort cellulaire
induite par la Lam-D. Par ailleurs, la Lam-D engendre une réponse aux dommages à l’ADN
générés par son effet inhibiteur de topoisomérase-I, résultant en la phosphorylation de
l’histone H2AXγ, l’expression de la protéine de réparation Rad51 et de p53. Grâce à diverses
lignées de cellules cancéreuses, nous avons démontré que les mécanismes apoptotiques
induits par la Lam-D sont indépendants du statut p53 des cellules tumorales. De plus, des
cellules dépourvues de noyau (cytoplastes) subissent aussi l’apoptose induite par la Lam-D.
L’ensemble de ces résultats démontre que la Lam-D ne nécessite pas la signalisation nucléaire
pour promouvoir la mort des cellules cancéreuses et que la mitochondrie est la cible
primordiale responsable de son effet pro-apoptotique.
Ainsi, la Lamellarine-D et ses dérivés de synthèse, de par leur mécanisme d’action
original ciblant directement les mitochondries, sont capables d’induire l’apoptose de cellules
tumorales y compris résistantes aux chimiothérapies classiques (NSCLC, mélanomes).
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ABSTRACT.
Most anticancer treatments induce apoptosis of tumor cells in vitro and in vivo. The
common anticancer agents act on primitive cellular targets, mainly localized in nucleus, and
active subsequently different apoptotic pathways leading ultimately to cell death. Therefore,
resistance to apoptosis induction by classical chemotherapeutic compounds is a crucial
problem. Thus targeting others subcellular structures different from nucleus may be useful to
bypass in part phenomenon of apoptosis resistance. The mitochondria appear an interesting
target localized on crossroad of the different apoptotic pathways. Thus, new drugs targeting
the mitochondria have been identified. From them, our lab interested on the Lamellarins,
marine hexacyclic pyrrolic alkaloids. In addition to their inhibitor effects on nuclear
topoisomerases-I, Lamellarins also act on mitochondria of cancer cells.
My work consisted 1) on evaluating advantages of the Lamellarins in treatment of
resistant cancer cell lines with inefficient apoptotic pathways (non small carcinoma lung
cancer cells, NSCLC) and 2) on elucidating the apoptotic pathways activated by the
Lamellarins. Thereby, we tested effects of two potential anticancer agents from Lamellarins
class on a highly apoptosis-resistant NSCLC cell line. Both the Lamellarin-D (Lam-D) and its
synthetic amino derivative PM031379, act directly on mitochondria inducing the Bax
activation, the mitochondrial release of cytochrome-c and AIF, as well as the activation of
caspase-3. However the PM031379 only triggered cell death coupled to the nuclear
translocation of AIF. Furthermore, this lethal effect needs the generation of mitochondrial
reactive oxygen species (ROS). These results allowed understanding the mechanisms useful
to restore apoptosis in chemoresistant cells. 2) The second part of this work consisted on
characterizing the apoptotic pathways activated by the Lam-D by evaluating precisely the
nuclear and mitochondrial contributions on its pro-apoptotic effects. The Lam-D displays high
potent cytotoxicity against a large panel of tumors. In the micromolar range, Lam-D promoted
nuclear apoptosis in leukemia cells without prominent cell cycle arrest. Signals transmitted by
Lam-D initiated apoptosis via the mitochondrial intrinsic apoptotic pathway, activating Bax
and reducing the levels of anti-apoptotic proteins Bcl-2 and cIAP2 in association with
activation of caspases-9 and -3. Our results indicate that cell death induced by Lam-D was
independent of the extrinsic apoptotic pathway. Lam-D also exerted a topoisomerase I-
mediated DNA damage response resulting in phosphorylation of H2AX, upregulation of the
repair protein Rad51 and of p53. However, using several cancer cell lines, we have shown
that the mechanism of apoptosis induced by Lam-D is independent of the p53 status of the
tumor cells. Furthermore sensitivity to Lam-D was abrogated in enucleated cells (cytoplasts).
Altogether these results demonstrate that the Lam-D exerts its cytotoxic effects by inducing
mitochondrial apoptosis and that these effects can be initiated independently of nuclear
signaling. The mitochondria are the fundamental target responsible of its pro-apoptotic effect.
Thus the Lam-D and its synthetic derivative, by an original action mechanism
targeting directly mitochondria, are able to induce apoptosis of cancer cells resistant to
conventional chemotherapies (NSCLC, melanoma).
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