antiviral aktive Substanzen

191 Pages·2009·7.54 MB·English

Sulfoquinovosyldiacylglyceride – antiviral aktive Substanzen

Der Technischen Fakultät der Universität Erlangen-Nürnberg
zur Erlangung des Grades

D O K T O R - I N G E N I E U R

vorgelegt von
Ivonne Naumann

Erlangen - 2009
Als Dissertation genehmigt von
der Technischen Fakultät
der Universität Erlangen-Nürnberg

Tag der Einreichung: 27.10.2008
Tag der Promotion: 06.03.2009

Dekan:
Prof. Dr.-Ing. Johannes Huber
Berichterstatter:
Prof. Dr. Rainer Buchholz
Prof. Dr. Monika Pischetsrieder
Für meine Eltern
Heinz und Ingrid Naumann
„Es ist ein verdammt langer Weg
vom Grund des Meeres bis in die Apotheke!“
(Prof. Dr. Brümmer & Prof. Dr. Schill, 2006)
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis
Abkürzungsverzeichnis.......................................................................................VI
Zusammenfassung.................................................................................................IX
Abstract.................................................................................................................XII
1 Einleitung.....................................................................................................1
2 Stand des Wissens......................................................................................3
2.1 Humane Herpesviren...............................................................................3
2.1.1 Humanes Cytomegalievirus..............................................................4
2.1.1.1 Pathologie.......................................................................................4
2.1.1.2 Infektionszyklus............................................................................5
2.1.2 Virustatika............................................................................................6
2.1.2.1 Synthetische Virustatika..............................................................6
2.1.2.2 Natürliche antivirale Wirkstoffkandidaten...............................8
2.1.3 Drug Discovery.................................................................................10
2.1.3.1 Target Zytotoxizität....................................................................10
2.1.3.2 Target HIV-Reverse Transkriptase..............................................11
2.1.3.3 Target Humanes Cytomegalievirus.........................................12
2.2 Sulfoglycolipide als pharmazeutische Wirkstoffkandidaten...........13
2.2.1 Sulfoquinovosyldiacylglyceride – Struktur und Vorkommen...13
2.2.2 SQDG – Biosynthese und Funktion...............................................14
2.2.3 Pharmazeutisches Potential der SQDG.........................................16
2.2.4 Pharmazeutisches Potential weiterer Sulfoglycolipide...............19
2.2.5 Strukturcharakterisierung - MALDI trap ToF Hybrid MSn........20
2.2.5.1 MALDI ToF in der Lipidanalytik.............................................21
2.3 Neue Therapeutika aus phototrophen Mikroorganismen................23
2.3.1 Phototrophe Mikroorganismen – Mikroalgen
und Cyanobakterien.........................................................................23
2.3.2 Kultivierung phototropher Mikroorganismen.............................25
2.3.2.1 Photosynthese..............................................................................25
2.3.2.2 Kultivierungsbedingungen.......................................................26
2.3.2.3 Photobioreaktoren......................................................................28
3 Problemstellung........................................................................................33
4 Material und Methoden..........................................................................35

I -
- Seite
Inhaltsverzeichnis
4.1 Kultivierung phototropher Mikroorganismen...................................35
4.1.1 Verwendete Mikroorganismen.......................................................35
4.1.2 Photobioreaktor-Screening-Modul.................................................35
4.1.3 Verwendete Medien und Kultivierungsbedingungen................36
4.1.4 Vorkulturführung/Inokulieren.......................................................38
4.1.5 Untersuchungen zur Optimierung der SQDG-Produktion........38
4.1.6 Prozessbegleitende Analytik...........................................................39
4.1.6.1 Messung der Optischen Dichte.................................................39
4.1.6.2 Bestimmung der Biotrockenmassekonzentration..................40
4.1.6.3 Ermittlung der Zellzahl..............................................................40
4.1.6.4 Messung des pH-Wertes............................................................41
4.1.6.5 Bestimmung der maximalen spezifischen Wachstumsrate..41
4.1.6.6 Bestimmung der Raum-Zeit-Ausbeute....................................41
4.1.7 Ernte der Biomasse...........................................................................41
4.2 Aufarbeitung der SQDG........................................................................42
4.2.1 Verwendete Lösungsmittel und Salze...........................................42
4.2.2 Extraktion...........................................................................................42
4.2.3 Dünnschichtchromatographie........................................................43
4.2.3.1 Analytische Dünnschichtchromatographie............................43
4.2.3.2 Präparative Dünnschichtchromatographie.............................44
4.2.4 Adsorption/Desorptions-Trennverfahren.....................................44
4.2.5 Zweiphasensystem (Folch wash)....................................................46
4.2.6 Isolierung der Ac-SQDG..................................................................46
4.3 Strukturcharakterisierung und Quantifizierung................................47
4.3.1 MALDI trap ToF Hybrid MSn........................................................47
4.3.1.1 Matrix und Technikoptimierung..............................................47
4.3.2 Enzymatischer Verdau.....................................................................48
4.3.3 Quantifizierung der SQDG mittels LC-MS...................................49
4.4 Biologische Assays..................................................................................50
4.4.1 Kultivierung der Wirtszellen..........................................................50
4.4.2 Herstellung des Virusstocks............................................................50
4.4.3 Bestimmung der antiviralen Aktivität...........................................51
4.4.4 Weiterführende Untersuchungen...................................................52

II -
- Seite
Inhaltsverzeichnis
4.4.5 Assay der Inhibierung der HIV-Reversen Transkriptase
(HIV-RT).............................................................................................54
5 Ergebnisse.................................................................................................56
5.1 Stammauswahl von potentiellen SQDG-Produzenten......................56
5.2 Kultivierungen........................................................................................57
5.2.1 Rhodophyta.......................................................................................57
5.2.2 Heterokonotphyta.............................................................................58
5.2.3 Chlorophyta.......................................................................................59
5.2.4 Cyanophyta........................................................................................60
5.3 Down Stream Processing der SQDG....................................................61
5.3.1 Etablierung.........................................................................................61
5.3.1.1 Dünnschichtchromatographie..................................................61
5.3.1.2 Adsorptions/Desorptions-Trennverfahren.............................61
5.3.1.3 Zweiphasensystem (Folch wash)..............................................62
5.3.2 SQDG in phototrophen Mikroorganismen...................................63
5.3.2.1 Rhodophyta.................................................................................63
5.3.2.2 Heterokontophyta.......................................................................64
5.3.2.3 Chlorophyta.................................................................................65
5.3.2.4 Cyanophyta..................................................................................65
5.3.3 Ac-SQDG in phototrophen Mikroorganismen.............................66
5.3.3.1 Heterokontophyta.......................................................................66
5.3.4 Etablierung einer Trennmethode für Ac-SQDG...........................67
5.4. Strukturcharakterisierung mittels MALDI trap ToF Hybrid MSn...68
5.4.1 Matrixoptimierung...........................................................................68
5.4.2 MALDI ToF des SQDG-Standards.................................................70
5.4.2.1 Untersuchungen des SQDG-Standards im MS1.....................70
5.4.2.2 Untersuchungen des Standards im MS2 und MS3..................71
5.4.3. MALDI ToF der SQDG aus phototrophen Mikroorganismen...72
5.4.3.1 Rhodophyta.................................................................................72
5.4.3.2 Heterokontophyta.......................................................................76
5.4.3.3 Chlorophyta.................................................................................79
5.4.3.4 Cyanophyta..................................................................................79
5.4.3.5 Zusammenfassung der identifizierten SQDG........................83

III -
- Seite
Inhaltsverzeichnis
5.4.4 MALDI ToF von Ac-SQDG aus phototrophen Mikroorganismen.....84
5.4.4.1 Heterokontophyta.......................................................................84
5.4.5 MS-Analyse separierter Ac-SQDG/SQDG-Fraktionen................85
5.4.6 Enzymatischer Verdau der Ac-SQDG...........................................88
5.5 HPLC-ESI-Massenspektrometrie zur Quantifizierung von SQDG.89
5.5.1 Etablierung der chromatographischen Trennung........................89
5.6 Untersuchung zur Optimierung der SQDG-Bildung........................92
5.6.1 Variation der Bestrahlungsstärke...................................................92
5.6.2 Variation der Phosphatquelle/-konzentration..............................95
5.7 Biologische Aktivitäten der SQDG/Ac-SQDG....................................98
5.7.1 Antiviraler Bioassay mit HCMV.....................................................98
5.7.1.1 Herstellung von hochtitrigen Virusstöcken............................98
5.7.1.2 Vergleich der Assays IE-POX und DE-POX.........................100
5.7.1.3 Etablierung des HCMV-Assays mit Standardsubstanzen..101
5.7.2 Anti-HCMV-Aktivität der SQDG.................................................102
5.7.2.1 Rhodophyta...............................................................................102
5.7.2.2 Heterokontophyta.....................................................................103
5.7.2.3 Cyanophyta................................................................................104
5.7.3 Anti-HCMV-Aktivität und Zytotoxizität der SQDG.................105
5.7.4 Anti-HCMV-Aktivität und Zytotoxizität der Ac-SQDG...........107
5.7.5 Enzymatischer Bioassay mit der Reversen Transkriptase von HIV108
5.7.5.1 Etablierung des HIV-Reverse Transkriptase-Assays..............108
5.7.6 Anti-HIV-RT-Aktivität der SQDG................................................109
5.7.6.1 Rhodophyta...............................................................................109
5.7.6.2 Heterokonotphyta.....................................................................110
5.7.6.3 Cyanophyta................................................................................111
5.7.6.4 Zusammenfassung der Anti-HIV-RT-Aktivitäten...............112
6 Fehlerbetrachung...................................................................................113
6.1 Prozessbegleitende Analytik...............................................................113
6.2 Aufarbeitungen der SQDG..................................................................113
6.3 MALDI trap ToF Hybrid MSn.............................................................114
6.4 HPLC-ESI-MS........................................................................................114
6.5 Biologische Assays................................................................................114

IV -
- Seite
Inhaltsverzeichnis
7 Diskussion...............................................................................................116
7.1 Selektion phototropher Mikroorganismen........................................116
7.2 Kultivierungen......................................................................................119
7.3 Down Stream Processing für SQDG..................................................121
7.3.1 Etablierung der Trennmethoden für SQDG...............................121
7.3.2 SQDG in phototrophen Mikroorganismen.................................124
7.3.3 Ac-SQDG in phototrophen Mikroorganismen...........................125
7.3.4 Etablierung chromatographischer Trennmethoden für Ac-SQDG...125
7.4 MALDI trap ToF Hybrid MSn Massenspektrometrie......................126
7.4.1 Matrixoptimierung.........................................................................126
7.4.2 MALDI ToF des SQDG-Standards...............................................126
7.4.3 MALDI ToF von SQDG aus phototrophen Mikroorganismen127
7.4.4 MALDI ToF von Ac-SQDG aus phototrophen Mikroorganismen 134
7.5 HPLC-ESI-MS........................................................................................136
7.6 Untersuchungen zur Optimierung der SQDG-Bildung..................136
7.7 Antivirale Bioaktivität..........................................................................139
7.7.1 Antiviraler Bioassay mit HCMV...................................................139
7.7.2 Anti-HCMV Aktivität und Zytotoxizität der SQDG.................141
7.7.3 Anti-HCMV Aktivität und Zytotoxizität der Ac-SQDG...........145
7.7.4 Inhibierung der HIV-RT durch SQDG.........................................146
7.8 Gesamtfazit............................................................................................147
8 Ausblick und Perspektiven.................................................................149
9 Literaturverzeichnis...............................................................................151
10 Anhang.....................................................................................................168

V -
- Seite
Abkürzungen
Abkürzungsverzeichnis
AC Essigsäure
Ac-SQDG acylierte SQDG
Ac -SQDG zweifach acylierte SQDG
2
ACN Acetonitril
AIDS Aquired Immuno Deficiency Virus
APS Sulfat-Adenosin-5´-Phosphosulfat
APU Antigen producing units
ATP Adenosin Triphosphate
A/V Oberfläche/Volumen-Verhältnis
BTM Biotrockenmassekonzentration
CID collision induced decay
CHCA α-Cyanohydroxyzimtsäure
Cyt b /f Cytochrom b /f-Komplex
6 6
DAG Diacylglycerol
DC Dünnschichtchromatographie
DCM Dichlormethan
DE virale delayed early Proteine
DHB 2,5-Dihydroxybenzoesäure
DNA Desoxyribonucleinsäure
DS Dextransulfat
EBV Epstein Barr Virus
EGFR epidermal growth factor receptor
ECACC European Collection of cell cultures
EPS Exopolysaccharide
ESI Electro Spray Ionization
EtAc Ethylacetat
FACS Fluorescence Activated Cell Sorting
FKS Fötales Kälberserum
GFP Green Fluorescent Protein
gp Glycoprotein
GV Ganciclovir
IE virale immedeate early Proteine
HCMV Humaner Cytomegalovirus
HHV Humaner Herpesvirus
HIV Human Immunodeficiency Virus
VI -
- Seite