Antioxidative Wirkung und Hemmung des EGFR durch Apfelinhaltsstoffe

239 Pages·2010·2.32 MB·German

Antioxidative Wirkung und Hemmung des EGFR
durch Apfelinhaltsstoffe

Zur Erlangung des akademischen Grades eines

DOKTORS DER NATURWISSENSCHAFTEN

(Dr. rer. nat.)

der Fakultät für Chemie und Biowissenschaften der
Universität Karlsruhe (TH)
vorgelegte

DISSERTATION

von

Matthias Roth
aus Flein

Dekan: Prof. Dr. Stefan Bräse
Referent: Prof. Dr. Doris Marko
Korreferent: Prof. Dr. Manfred Metzler
Tag der mündlichen Prüfung: 11.02.2010

Für Sabine und Moritz

Der Gordische Knoten war in Wirklichkeit
ein Apfel

[Matthias Roth]

Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung 1
2 Theoretische Grundlagen 3
2.1 Epidermaler Wachstumsfaktorrezeptor (EGFR) 3
2.1.1 Struktur und Aufbau des EGFR 4
2.1.2 Ligandenbindung und Rezeptordimerisierung 6
2.1.3 Nachgeschaltete Signalwege 9
2.1.4 Hemmstoffe 11
2.1.5 Überexpression des EGFR bei Krebs 12
2.2 Oxidativer Stress 14
2.2.1 Redox-Cycling und Reaktive Sauerstoffspezies (ROS) 15
2.2.2 Nrf2/ARE – Signalweg 17
2.2.3 Glutathion 24
2.2.4 γ-Glutamylcysteinligase 25
2.3 Polyphenole 27
2.3.1 Phenolcarbonsäuren und ihre Derivate 27
2.3.2 Flavonoide 28
2.3.3 Gesundheitsfördernde Wirkung von Apfelphenolen 36
2.3.4 Polyphenolreiche Apfeltresterextrakte 38
3 Problemstellung 40
4 Ergebnisse und Diskussion 42
4.1 Zytotoxische und wachstumshemmende Eigenschaften von
polyphenolhaltigen Extrakten 42
4.1.1 Kurzzeit-Zytotoxizität 42
4.1.2 Zytotoxische Effekte von Apfeltresterextrakten 45
4.1.3 Wachstumshemmende Eigenschaften von Apfeltresterextrakten 49
4.1.4 Diskussion Zytotoxizität und Wachstumshemmung 53
4.2 Modulation der Aktivität des epidermalen Wachtumsfaktorrezeptors
durch Apfelpolyphenole 59
4.2.1 Apfelsaftextrakte 60
4.2.2 Reinsubstanzen und Extrakt-Fraktionen 69
4.2.3 Apfeltresterextrakte 85
4.2.4 Diskussion zur Modulation der Aktivität des epidermalen
Wachtumsfaktorrezeptors durch Apfelpolyphenole 92
4.3 Zelluläre Wirkung von Apfeltresterextrakten 103
4.3.1 Bildung von Wasserstoffperoxid unter Zellkulturbedingungen 105
4.3.2 Modulation des endogenen Redoxstatus 107
4.3.3 Modulation des zellulären Menadion-induzierten ROS-Status 108
4.3.4 Untersuchungen zur DNA-protektiven Wirkung von
Apfeltresterextrakten 111
4.3.5 DNA-schädigende Wirkung 117
4.3.6 Translokation von Nrf2 119
4.3.7 Induktion der γ-Glutamylcystein-Ligase (γ-GCL) 124
4.3.8 Modulation des Gesamtglutathiongehaltes 126
4.3.9 Diskussion zur zellulären Wirkung von Apfeltresterextrakten 128
5 Zusammenfassung 140
Inhaltsverzeichnis
6 Material und Methoden 144
6.1 Chemikalien und Geräteliste 144
6.1.1 Chemikalien 144
6.1.2 Eingesetzte Substanzen 145
6.1.3 Antikörper 146
6.1.4 Geräte 146
6.2 Zellkultur 147
6.2.1 Zelllinien 147
6.2.2 Medien und Lösungen 148
6.2.3 Passagieren der Zellen 148
6.2.4 Bestimmung der Zellzahl 149
6.2.5 Einfrieren und in Kultur nehmen von Zellstocks 150
6.2.6 Mycoplasmentest 151
6.3 Isolierung des EGFR 152
6.3.1 Kultivierung der Zellen 152
6.3.2 Isolierung des EGFR 152
6.3.3 Aufreinigung des EGFR 154
6.3.4 Beschichtung der Mikrotiterplatte mit Substrat 155
6.3.5 Testung der einzelnen EGFR Fraktionen auf ihre PTK-Aktivität 156
6.4 Bestimmung der Proteintyrosinkinaseaktivität mittels ELISA 157
6.5 Western Blot Analyse 161
6.5.1 Probenvorbereitung und Substanzinkubation 161
6.5.2 Gewinnung der Proteine 161
6.5.3 Proteinbestimmung nach Bradford 163
6.5.4 Auftrennung der Proteine durch SDS-PAGE 164
6.5.5 Transfer der Proteine auf eine Nitrocellulosemembran 168
6.5.6 Immunologische Detektion 170
6.5.7 Untersuchung des Transkriptionsfaktors Nrf2 mittels
Western Blot Analyse 172
6.6 Amplex® Red Hydrogen Peroxide Assay 174

6.7 Sulforhodamin B-Assay 176
6.8 Dichlorofluorescein (DCF)-Assay 178
6.9 Glutathionbestimmung 181
6.10 Real Time PCR 188
6.11 Comet Assay 195
6.12 Trypanblau-Auszählung 202
6.13 In vitro Fermentation 202
7 Literaturverzeichnis 206
8 Anhang 221
Abkürzungsverzeichnis

2-VP 2-Vinylpyrimidin
A431 humane Vulvakarzinomzelllinie
Abb. Abbildung
ACF aberrant Crypt Foci
AE02 polyphenolreicher Apfelsaftextrakt
AE03B polyphenolreicher Maischeextrakt
AG1478 spezifischer EGFR-Inhibitor Tyrphostin AG1478
AMP Adenosinmonophosphat
APS Ammoniumperoxodisulfat
ARE antioxidativ responsive Element
AS Aminosäure
ATP Adenosintriphosphat
Bcl-2 Familie pro- bzw. antiapoptotischer Proteine
BMBF Bundesministerium für Bildung und Forschung
BSA Rinderserumalbumin
bZIP “basic leucine zipper”
CaCo-2 humane Kolonkarzinomzelllinie
cAMP zyklisches Adenosinmonophosphat
cDNA „complementary DNA”
COMT Catechol-O-methyltransferase
DCF 2‘, 7‘-Dichlorfluorescein
DCFH-DA 2‘, 7‘-Dichlorfluorescin-Diacetat
DMEM “Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium”
DMH Dimethylhydrazin
DMSO Dimethylsulfoxid
DNA Desoxyribonukleinsäure
DSMZ Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen
DTNB 5, 5´-Dithiobis(2-Nitrobenzoesäure)
DTT Dithiothreitol
EC (-)-Epicatechin
ECG (-)-Epicatechingallat
EDTA Ethylendiamintetraessigsäure
EGC (-)-Epigallocatechin
EGCG (-)-Epigallocatechingallat
EGF epidermaler Wachstumsfaktor
EGFR epidermaler Wachstumsfaktorrezeptor
EGTA Ethylenglykolessigsäure
Elk-1 Transkriptionsfaktor Ets-like kinase
EtBr Ethidiumbromid
FKS Fetales Kälberserum
Fpg Formamidopyrimidin-DNA-Glykosylase
g Erdbeschleunigung
gDNA genomische DNA
GDP Guanosindiphosphat
GFP „green fluorescent protein“
GPX Glutathionperoxidase
Abkürzungsverzeichnis

GR Glutathionreduktase
Grb2 Adapterprotein „growth factor receptor-bound protein 2“
GSH Glutathion (reduzierte Form)
GSSG Glutathion (oxidierte Form)
GST Glutathion-S-Transferase
GTP Guanosintriphosphat
h Stunde
HEPES 2-(4-(2-Hydroxyethyl)- 1-Piperazinyl)-Ethansulfonsäure
HO1 Hämoxygenase 1
HR homologe Rekombination
HRP „Horseradish“ Peroxidase
HT29 Humane Kolonadenokarzinomzelllinie
IC „inhibitory concentration“
50
JNK/SAPK c-Jun-N-terminale Kinase, stress-induzierbare MAPK
kDa Kilo Dalton, Molekülmasse
Keap1 „Kelch-like ECH-associated protein 1“
KG Körpergewicht
LMA „low melting Agarose“
Lys Lysin
mA Milliampère
MAPK mitogen aktivierbare Proteinkinase
MAPKAP-K / p90rsk MAPK-aktivierte Kinase
MAPKK mitogen aktivierbare Proteinkinase Kinase
MAPKKK mitogen aktivierbare Proteinkinase Kinase Kinase
MEK1/2 MAPKK/ERK-Kinasen
MEM Minimum Essential Medium
min Minute
ml Milliliter
MLC Mauslymphomzellen
mM Millimolar
mTor mammalien Target of Rapamycin
Na+ Natrium
NADPH Nikotinamid-Adenin-Dinukleotidphosphat
NMA „normal melting Agarose“
NQO1 NAD(P)H-Chinonoxidoreduktase 1
Nrf2 „nuclear factor erythroid 2p45 (NF-E2)-related factor 2“
OT Objektträger
P/S Penicillin / Streptomycin
PAGE Polyacrylamid-Gelelektrophorese
PBS „phosphate buffered saline“
PCR „Polymerase chain reaction”
PEG Polyethylenglykol
PI3K Phosphatidylinositol-3-kinase
PIP Phosphatidylinositolphosphat
PIP2 Phosphatidylinositolbisphosphat
PK Proteinkinase
Abkürzungsverzeichnis

PMSF Phenylmethylsulfonylfluorid
POL Polymerase
PTK Proteintyrosinkinase
Que Quercetin
Raf Ser/Thr-Kinase
Ras Onkogen, GTP-abhängiges Schalterelement
RNA Ribonukleinsäure
ROS reaktive Sauerstoffspezies
rT relative Transkription
RTK Rezeptortyrosinkinase
RT-PCR Reversen Transkription PCR
s Sekunden
SD Standardabweichung
SDS Natriumdodecylsulfat
Ser Serin
SH1 zentrale Tyrosinkinasedomäne; Src-homologe Domäne 1
SOD Superoxiddismutase
Sos GDP/GTP-Austauschfaktor „son of sevenless“
SRB Sulforhodamin B
SSS Sulfosalicylsäure
T/C „test / control”
Tab. Tabelle
TAE Tris-Acetat-EDTA
tBHQ tert-Butylhydrochinon
TCA Trichloressigsäure
TEMED N, N, N’, N’-Tetramethylendiamin
tGSH „total“ Glutathion
Thr Threonin
Tyr Tyrosin
Ub Ubiquitin
UDP Uridindiphosphat
UGT UDP-Glukuronyltransferase
UGT UDP-Glukuronyltransferase
UV Ultraviolett
VEGFa-d vaskulärer endothelialer Wachstumsfaktor a-d
VEGFR2, 3 vaskulärer endothelialer Wachstumsfaktorrezeptor 2, 3
Y, Tyr Tyrosinrest
γ-GCL γ-Glutamylcysteinligase
μl Mikroliter
μM Mikromolar
Einleitung

1 Einleitung

In den westlichen Industrieländern stellen Tumorerkrankungen neben Erkrankungen
des Herz-Kreislaufsystems eine der häufigsten Todesursachen dar. Bei
Krebserkrankungen liegen insbesondere Tumore des Dick- und Mastdarmes in den
Statistiken sowohl bei Männer, als auch bei Frauen mit an vorderster Stelle
[Statistiken Robert-Koch-Institut 2003; „Harvard Reports on Cancer Prevention“,
1996]. Hierfür werden besonders, neben genetischer Disposition, die ungünstigen
Ernährungsgewohnheiten der westlichen Welt verantwortlich gemacht, die sich durch
fette, ballaststoffarme Ernährung auszeichnen. Hinzu kommt noch der Konsum von
Genussgiften, wie Alkohol und Zigaretten, deren Abbauprodukte und Toxine
ebenfalls auf den gesamten Gastrointestinaltrakt eine schädliche Wirkung entfalten
können.
Dem gegenüber wird der Verzehr pflanzlicher Lebensmittel und daraus hergestellter
Produkte, wie z. B. Fruchtsäften, mit gesundheitlich positiven Effekten verbunden. So
hat sich im Volksmund bereits früh der Spruch „An apple a day, keeps the doctor
away“ herausgebildet. Wobei dieser Spruch sich ursprünglich auf den hohen
Vitamingehalt bezog und mehr einen Schutz vor Infektionskrankheiten meinte, als die
möglichen chemopräventiven Eigenschaften durch die als sekundäre
Pflanzeninhaltsstoffe enthaltenen Polyphenole. Von einheimischen Früchten nimmt
insbesondere der Apfel eine herausragende Rolle ein. So konsumiert der deutsche
Durchschnittsverbraucher im Jahr ungefähr 40 Liter Fruchtsaft, wovon etwa 10 Liter
allein auf Apfelsäfte entfallen. Im Jahr 2005 wurden ca. 1,33 Mio. Tonnen Äpfel
geerntet und 405 Mio. Liter Apfelsaft produziert [VDF, 2006]. Somit stellen Äpfel und
daraus hergestellte Produkte auch einen bedeutenden Wirtschaftsfaktor dar.
Da durch entsprechende Aufklärungskampagnen das Gesundheitsbewusstsein der
Bevölkerung zugenommen hat und demzufolge auch eine zunehmende
Sensibilisierung für eine gesundheitsbewußte Ernährung stattgefunden hat, reagiert
der Lebensmittelsektor darauf mit einem steigenden Angebot an „funktionellen
Lebensmitteln“, die mit pflanzlichen Extrakten und Einzelkomponenten angereichert
sind und entsprechend der „Health Claims“ Verordnung eine gesundheitsfördernde
Wirkung aufweisen sollen.
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