Analytische Untersuchungen zu Polysacchariden aus Viscum album L.

214 Pages·2008·1.2 MB·German

Analytische Untersuchungen
zu Polysacchariden aus
Viscum album L.

Dissertation
zur Erlangung des Doktorgrades
der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät
der Christian-Albrechts-Universität
zu Kiel

vorgelegt von
Bernadette Margot Herbst

Kiel 2008
Referent: Prof. Dr. W. Blaschek
Korreferent: Prof. Dr. E. Maser
Tag der mündlichen Prüfung: 4.11.2008
Zum Druck genehmigt: Kiel, 4.11.2008

Prof. Dr. Lutz Kipp
(Dekan)
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis
1 EINLEITUNG UND ZIELSETZUNG................................................................- 1 -
1.1 Die Mistel....................................................................................................- 1 -
1.1.1 Taxonomie und Botanik.....................................................................................................- 1 -
1.1.2 Historische Einordnung und Verwendung.........................................................................- 4 -
1.1.3 Inhaltsstoffe und ihre Wirkungen.......................................................................................- 6 -
1.1.3.1 Polysaccharide...................................................................................................................- 7 -
1.1.3.2 Lektine................................................................................................................................- 8 -
1.1.3.3 Viscotoxine.........................................................................................................................- 9 -
1.1.4 Mistelextrakte und deren Anwendung in der adjuvanten Krebstherapie.........................- 10 -
1.2 Arabinogalactan-Proteine.......................................................................- 11 -
1.3 Zielsetzung der Arbeit.............................................................................- 14 -
2 EXPERIMENTELLER TEIL...........................................................................- 15 -
2.1 Methoden zur Extraktion und Isolierung ...............................................- 15 -
2.1.1 Extraktherstellung aus Mistelkraut...................................................................................- 15 -
2.1.1.1 Herstellung eines Kaltextrakts.........................................................................................- 15 -
2.1.1.2 Herstellung eines Heißextrakts........................................................................................- 16 -
2.1.2 Extraktherstellung aus Mistelbeeren................................................................................- 16 -
2.1.3 Synthese des β-glucosyl-Yariv-Reagenzes.....................................................................- 18 -
2.1.4 Fällung der AGPs mit dem β-glucosyl-Yariv-Reagenz....................................................- 19 -
2.1.5 Arabinan-Isolierung aus dem Überstand der Yariv-Fällung.............................................- 20 -
2.1.5.1 Fraktionierte Arabinan-Isolierung.....................................................................................- 20 -
2.1.5.2 Unfraktionierte Arabinan-Isolierung.................................................................................- 21 -
2.2 Methoden der Chemie und Chromatographie.......................................- 22 -
2.2.1 Geldiffusionstest...............................................................................................................- 22 -
2.2.2 Keimzahlbestimmung.......................................................................................................- 22 -
2.2.3 Antioxidative Testungen...................................................................................................- 23 -
2.2.3.1 Lipophile Substanzen.......................................................................................................- 23 -
2.2.3.2 Hydrophile Substanzen (Rechner, 2004).........................................................................- 24 -
2.2.4 Acetylierung.....................................................................................................................- 25 -
2.2.4.1 Bestimmung des Responsefaktors für die Acetylierung..................................................- 26 -
2.2.5 Uronsäure-Bestimmung nach Blumenkrantz und Asboe-Hansen (1973)........................- 27 -
I
Inhaltsverzeichnis
2.2.6 Uronsäure-Reduktion nach Taylor und Conrad (1972)....................................................- 28 -
2.2.7 Konduktometrische Uronsäure-Bestimmung...................................................................- 28 -
2.2.8 Partialhydrolyse nach Gleeson und Clarke (1979)..........................................................- 29 -
2.2.9 Methylierungsanalyse nach Harris et al. (1984)..............................................................- 30 -
2.2.10 Aminosäureanalytik..........................................................................................................- 33 -
2.2.10.1 Kraut-AGP........................................................................................................................- 33 -
2.2.10.2 Beeren-AGP.....................................................................................................................- 34 -
2.2.11 Aufarbeitung von Mistellektin zu Vergleichszwecken......................................................- 34 -
2.2.12 Gelpermeationschromatographie (GPC).........................................................................- 35 -
2.2.12.1 Sephacryl S-400 Säule....................................................................................................- 35 -
2.2.12.2 PL-GPC-50 plus...............................................................................................................- 37 -
2.3 Methoden der Immunologie....................................................................- 39 -
2.3.1 ELISA...............................................................................................................................- 39 -
2.3.1.1 Kompetitiver ELISA..........................................................................................................- 39 -
2.3.1.2 Indirekter ELISA...............................................................................................................- 41 -
2.3.2 Entfernung von Endotoxinen............................................................................................- 43 -
2.3.3 Limulus-Amöbozyten-Lysat-Test.....................................................................................- 43 -
2.3.4 Lipopeptid-Entfernung......................................................................................................- 44 -
2.3.5 Testung der AGPs auf Kontamination mit Mistellektinen.................................................- 44 -
2.3.6 Entfernung von Lektinen in den AGP-Präparationen durch Pronase-Behandlung.........- 45 -
2.3.7 Aktivitätstestung an Toll-Like-Rezeptoren.......................................................................- 45 -
2.3.8 Immunfluoreszenz-Markierung........................................................................................- 46 -
3 ERGEBNISSE...............................................................................................- 50 -
3.1 Isolierung und Analytik...........................................................................- 50 -
3.1.1 Isolierungsgang und Extrakt-Ausbeuten..........................................................................- 50 -
3.1.1.1 Mistelkraut........................................................................................................................- 50 -
3.1.1.2 Mistelbeeren.....................................................................................................................- 51 -
3.1.2 Geldiffusionstest...............................................................................................................- 51 -
3.1.2.1 Mistelkraut........................................................................................................................- 51 -
3.1.2.2 Mistelbeeren.....................................................................................................................- 53 -
3.1.2.3 Vergleich Mistelbeeren und Mistelkraut...........................................................................- 53 -
3.1.3 Keimzahlbestimmung.......................................................................................................- 54 -
3.1.4 Antioxidative Testungen...................................................................................................- 55 -
3.1.4.1 Lipophile Substanzen.......................................................................................................- 55 -
3.1.4.2 Hydrophile Substanzen....................................................................................................- 56 -
3.1.5 Neutralzucker-Zusammensetzung der einzelnen Extrakt-Fraktionen..............................- 57 -
II
Inhaltsverzeichnis
3.1.5.1 Mistelkraut........................................................................................................................- 57 -
3.1.5.2 Mistelbeeren.....................................................................................................................- 62 -
3.1.6 Neutralzucker-Zusammensetzung der AGPs..................................................................- 64 -
3.1.6.1 Mistelkraut........................................................................................................................- 64 -
3.1.6.2 Mistelbeeren.....................................................................................................................- 67 -
3.1.7 Neutralzucker-Zusammensetzung der Überstände der Yariv-Fällungen........................- 70 -
3.1.7.1 Mistelkraut........................................................................................................................- 70 -
3.1.7.2 Mistelbeeren.....................................................................................................................- 73 -
3.1.8 Neutralzucker-Zusammensetzung der Arabinane...........................................................- 75 -
3.1.8.1 Fraktionierte Arabinan-Isolierung aus Mistelkraut...........................................................- 75 -
3.1.8.2 Unfraktionierte Arabinan-Isolierung.................................................................................- 77 -
3.1.8.2.1 Mistelkraut........................................................................................................................- 77 -
3.1.8.2.2 Mistelbeeren.....................................................................................................................- 79 -
3.1.9 Uronsäure-Bestimmung nach Blumenkrantz und Asboe-Hansen (1973)........................- 83 -
3.1.10 Uronsäure-Reduktion nach Taylor und Conrad (1972)....................................................- 84 -
3.1.10.1 Mistelkraut........................................................................................................................- 85 -
3.1.10.2 Mistelbeeren.....................................................................................................................- 86 -
3.1.11 Konduktometrische Uronsäure-Bestimmung...................................................................- 86 -
3.1.12 Partialhydrolyse................................................................................................................- 88 -
3.1.12.1 Mistelkraut........................................................................................................................- 88 -
3.1.12.2 Mistelbeeren.....................................................................................................................- 90 -
3.1.13 Bestimmung der Bindungstypen......................................................................................- 93 -
3.1.13.1 Mistelkraut........................................................................................................................- 95 -
3.1.13.1.1 AGP und Derivate............................................................................................................- 95 -
3.1.13.1.2 Arabinan………………………………………………………………………………………..- 101 -
3.1.13.2 Mistelbeeren...................................................................................................................- 104 -
3.1.14 Aminosäureanalytik........................................................................................................- 114 -
3.1.14.1 Kraut-AGP......................................................................................................................- 114 -
3.1.14.2 Beeren-AGP...................................................................................................................- 115 -
3.1.15 Gelpermeationschromatographie...................................................................................- 116 -
3.1.15.1 Sephacryl S-400 Säule..................................................................................................- 116 -
3.1.15.2 PL-GPC-50 plus.............................................................................................................- 118 -
3.2 Immunologie ..........................................................................................- 122 -
3.2.1 ELISA.............................................................................................................................- 122 -
3.2.1.1 Kompetitiver ELISA........................................................................................................- 122 -
3.2.1.1.1 Polyklonale Antikörper...................................................................................................- 122 -
3.2.1.1.2 Monoklonaler Antikörper................................................................................................- 124 -
3.2.1.2 Indirekter ELISA.............................................................................................................- 130 -
III
Inhaltsverzeichnis
3.2.2 Limulus-Amöbozyten-Lysat-Test...................................................................................- 131 -
3.2.2.1 Mistelkraut......................................................................................................................- 131 -
3.2.2.2 Mistelbeeren...................................................................................................................- 132 -
3.2.3 Testung auf Kontamination mit Mistellektinen...............................................................- 134 -
3.2.4 Entfernung von Lektinen in den AGP-Präparationen durch Pronase-Behandlung.......- 135 -
3.2.4.1 Gelpermeationschromatographie der Kraut-AGP-Präparation nach
Pronase-Behandlung.....................................................................................................- 135 -
3.2.4.2 LAL-Test der Kraut-AGP-Präparation nach Pronase-Behandlung................................- 136 -
3.2.5 Geldiffusionstest vor der Testung an Toll-Like-Rezeptoren...........................................- 138 -
3.2.5.1 Kraut-AGP-Präparation vor und nach Pronase-Behandlung.........................................- 138 -
3.2.5.2 Kraut-AGP-Präparation vor und nach Pronase-Behandlung, Endotoxin-Entfernung
und Lipopeptid-Entfernung............................................................................................- 139 -
3.2.6 Aktivitätstestung an Toll-Like-Rezeptoren.....................................................................- 140 -
3.2.6.1 TLR 4.............................................................................................................................- 140 -
3.2.6.2 TLR 2.............................................................................................................................- 143 -
3.2.7 Immunfluoreszenz-Markierung......................................................................................- 146 -
4 DISKUSSION DER ERGEBNISSE.............................................................- 153 -
5 ZUSAMMENFASSUNG..............................................................................- 181 -
6 ABSTRACT.................................................................................................- 182 -
7 LITERATURVERZEICHNIS........................................................................- 183 -
LEBENSLAUF
ERKLÄRUNG

IV
Abkürzungsverzeichnis
Abkürzungsverzeichnis
ABTS 2,2-Azinobis-(3-ethylbenzothiazolin-6-sulfonsäure)
AGP Arabinogalactan-Protein
alk. alkalisch
Aqua bidest. Aqua bidestillata
Aqua dem. Aqua demineralisata
Borax Dinatriumtetraborat
BSA bovines Serumalbumin
CD cluster of differentiation
CLSM Konfokales-Laser-Raster-Mikroskop
Da Dalton
DABCO 1,4-Diazabicyclo-(2,2,2)-octan
Dimsyl- Dimethylsulfinyl-
DMSO Dimethylsulfoxid
DPPH N,N-Diphenyl-N`-(2,4,6-trinitrophenyl)-hydrazyl
ELISA enzyme linked immunosorbent assay
EtOH Ethanol
EU Endotoxin-Units (Endotoxin-Einheiten)
FID Flammenionisationsdetektor
FITC Fluoreszeinisothiocyanat
GLC Gas-Liquid Chromatography/Chromatogram
GM-CSF Granulozyten/Makrophagen-koloniestimulierender Faktor
GPC Gelpermeationschromatographie/-chromatogramm
HCl Salzsäure
HEK Human-Embryonic-Kidney
HPLC Hochleistungsflüssigkeitschromatographie
IC50 Konzentration, bei der eine Hemmung von 50% erfolgt
IgG Immunglobulin G
IL Interleukin
IFN-γ Interferon γ
KBE koloniebildende Einheiten
kDa Kilo-Dalton
KSE Kontroll-Standard-Endotoxin
LAK Lymphokin-aktivierte Killerzellen
LAL Limulus-Amöbozyten-Lysat
LPS Lipopolysaccharid
MALLS Multi-Angle-Laser-Light-Scattering
ML Mistellektin
V
Abkürzungsverzeichnis
MS Massenspektrometrie
MW Molekulargewicht
MWCO molecular weight cut off (Molekulargewichtsausschlussgrenze)
NaCl Natriumchlorid
NaN Natriumazid
3
NaNO Natriumnitrit
2
NaNO Natriumnitrat
3
NaOH Natriumhydroxid
NK-Zellen natürliche Killerzellen
p.a. pro analysi
PAGE Polyacrylamidgelelektrophorese
PAMP pathogen associated molecular pattern (Pathogen-assoziierte molekulare Muster)
PBS Phosphat gepufferte Salzlösung
PMAA partiell methyliertes Alditolacetat
PTH Phenylthiohydantoin
RI Refraktionsindex
RP Reversed Phase
RT Raumtemperatur
SDS Sodiumdodecylsulfat
TBS Tris-gepufferte Salzlösung
TEAC Trolox-Equivalent-Antioxidative-Capacity
TFA Trifluoressigsäure
TFF Tangentialflussfiltration
TIC Totalionenchromatogramm
TLR Toll-Like-Rezeptor
TNF-α Tumornekrosefaktor α
Tris Tris(hydroxymethyl)-aminomethan
US Uronsäure
US-Red. Uronsäure-Reduktion

VI
Abkürzungsverzeichnis
Aminosäuren
Ala Alanin
Arg Arginin
Asx Asparagin/-säure
Cys Cystein
Glx Glutamin-/säure
Gly Glycin
His Histidin
Hpro Hydroxyprolin
Ile Isoleucin
Leu Leucin
Lys Lysin
Met Methionin
Phe Phenylalanin
Pro Prolin
Ser Serin
Thr Threonin
Trp Tryptophan
Tyr Tyrosin
Val Valin
Monosaccharide
Ara Arabinose
Fuc Fucose
Gal Galactose
GalA Galacturonsäure
Glc Glucose
GlcA Glucuronsäure
Ino Inositol
Man Mannose
Rha Rhamnose
Xyl Xylose

VII
Abkürzungsverzeichnis
Extraktbezeichnungen
K I Krautextrakt I
K IIa Heißextrakt von K II
B I Beerenextrakt I
Fil TFF Filtrat der Tangentialflussfiltration
Ret TFF Retentat der Tangentialflussfiltration
Ret Dia dialysiertes Retentat der Tangentialflussfiltration
YF 1 Yariv-Fällung 1
YF 1 R Rückstand von YF 1 = AGP
YF 1 Ü Überstand von YF 1
YF 1 Ü 80 % EtOH R Rückstand der 80 %igen EtOH-Fällung vom Überstand von YF 1
YF 1 Ü 80 % EtOH Ü Überstand der 80 %igen EtOH-Fällung vom Überstand von YF 1 = Arabinan
USR Uronsäure-Reduktion
PR Partialhydrolyse-Rückstand
PÜ Partialhydrolyse-Überstand
AGP B AGP aus Mistelbeeren
AGP E AGP aus Echinacea purpurea
AGP K AGP aus Mistelkraut

VIII