analisis metagenom untuk pencirian komunitas bakteri dan fungi pada tempe cecilia anna ...

99 Pages·2013·1.17 MB·Indonesian

1
ANALISIS METAGENOM UNTUK PENCIRIAN KOMUNITAS BAKTERI
DAN FUNGI PADA TEMPE
CECILIA ANNA SEUMAHU
SEKOLAH PASCA SARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2012
2
PERNYATAAN MENGENAI DISERTASI DAN SUMBER INFORMASI
Dengan ini saya menyatakan bahwa disertasi berjudul ‘Analisis Metagenom
untuk Pencirian Komunitas Bakteri dan Fungi pada Tempe’ adalah karya
saya sendiri dan belum diajukan dalam bentuk apapun kepada perguruan tinggi
dimanapun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang
diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks
dandicantumkan dalam Daftar Pustaka dalam disertasi ini.
Bogor, September 2012
Cecilia Anna Seumahu
G361080011
3
ABSTRACT
CECILIA ANNA SEUMAHU, Metagenome Analysis to fingerprint Bacterial and
Fungi Communities in Tempe. Supervised by ANTONIUS SUWANTO (Major
Advisor), IMAN RUSMANA, DEDY DURYADI SOLIHIN (Co advisor).
Tempe is an Indonesian traditional fermented food produced using
Rhizopus as a starter culture. In practice, however, the starter culture as well as
fermentation processes would involved a polymicrobial fermentation, which
generated a unique tempe flavor and texture. This condition makes Indonesian
tempe as one of the most complex fermented food, while at the same time would
make it difficult to scale up tempe production with uniform quality and
consistency. Because of complex microbial communities involved, culture-
independent methods or metagenomic analysis would be an essential tool to
unravel this complex microbial fermentation. The aim of this study was to
compare a number of tempe microbial communities based on Amplified
Ribosomal Intergenic Sequence Analysis (ARISA). Fresh tempe samples were
obtained from tempe producers in Java and Moluccas. 16S rRNA gene libraries
and DNA sequencing were employed to analyze further the nature of microbial
diversity in two selected tempe samples. The results of our study showed that
different tempe producer possessed different Bacterial ARISA (BARISA) or fungi
ARISA (FARISA) profiles. However, BARISA profiles were found to be more
discriminative than FARISA, and therefore BARISA would be more useful for
tempe genetic fingerprint or barcoding. Bacterial communities in two tempe
samples (EMP and SDJD) were further investigated employing DNA sequence
analysis of their 16S rRNA gene libraries. Sequences closely related to Klebsiella
sp were found to be the majority among bacterial communities present in SDJD
sample, while sequences closely related to Acetobacter sp. were found as
predominant isolates in EMP samples. These significant differences in bacterial
communities might reflect differences in tempe flavor or texture associated with
their unique production or locality.
Key Word: Tempe microbial community, ARISA, barcoding system.
4
RINGKASAN
Sebagai makanan fungsional tradisional Indonesia, tempe dikonsumsi
dalam jumlah yang relatif tinggi dan dapat ditemukan dalam berbagai variasi jenis
dan cara pengolahan. Variasi ini perlu dijaga karena menjadi ciri khas makanan
Indonesia yang dapat dikembangkan dalam menghadapi program perdagangan
bebas ASEAN. Walau demikian, database mikroorganisme yang terlibat dalam
proses fermentasi tempe belum pernah dibuat dan ditelaah peluang adanya
hubungan antara rasa tempe yang berbeda pada daerah sentra produksi terhadap
komposisi mikroorganisme dan jaminan keamanan pangannya
Dalam proses pengolahannya, fermentasi tempe tidak hanya melibatkan
cendawan tetapi juga melibatkan bakteri. Upaya mempelajari total komunitas
mikroorganisme yang terlibat, dapat dilakukan dengan menggunakan metode
deteksi yang cukup sensitif dalam memberi gambaran secara menyeluruh. Teknik
tidak terkultur merupakan teknik yang dapat memberi gambaran tentang
komposisi mikroorganisme terkultur maupun tidak terkultur dari suatu lingkungan
ekologi. Kendala yang dihadapi dalam menggunakan teknik ini adalah pada
metode ekstraksi DNA sebagai tahapan awal yang penting. Rendemen dan
kualitas DNA yang rendah dapat mengurangi profil keragaman yang dapat
diperoleh dari suatu lingkungan ekologi. Permasalahan ini dapat diatasi dengan
melakukan pemilihan dan optimasi metode analisa yang dapat memberikan hasil
yang reprodusibel. Pada penelitian ini telah dilakukan optimasi metode ekstraksi
DNA dari sampel tempe sehingga diperoleh suatu metode standar yang dapat
digunakan untuk mempelajari total komunitas mikroorganisme pada tempe.
Optimasi dilakukan dengan membandingkan kemampuan dua kit komersil
(Fermentas DNA Purification Kit-FDEK dan PowerFood Microbian DNA
Isolation Kit-PFMDIK) untuk melakukan analisis metagenom mikroorganisme
yang ada di tempe. Berdasarkan hasil dari beberapa parameter yang diamati,
metode PFMDIK sangat baik digunakan untuk menganalisis keragaman
mikroorganisme di tempe secara metagenomik. Metode ini memberikan rendemen
dan kualitas DNA tinggi sehingga dapat diperoleh hasil PCR yang reprodusibel
dan ragam mikroorganisme yang lebih tinggi daripada metode FDEK. Parameter
yang dipakai sebagai data penunjang hasil ini adalah pengukuran konsentrasi
5
DNA serta kemurnian DNA dengan rasio 260/280, amplifikasi gen 16S rRNA,
visualisasi hasil amplifikasi sekuen ITS 16S-23S rRNA serta analisis ARISA
untuk komunitas bakteri dan fungi di tempe.
Hasil penelitian selanjutnya juga menunjukkan bahwa sidik jari komunitas
mikroorganisme dari delapan tempe yang berasal dari delapan pengrajin berbeda
menunjukkan ragam dan komposisi mikroorganisme berbeda. Hasil analisis
BARISA menunjukkan bahwa tidak ada satupun Operational Taxonomic Unit
(OTU) dalam BARISA type dengan ukuran sama yang dapat ditemukan pada
kedelapan contoh tempe dari pengrajin berbeda. Sebaliknya diperoleh delapan
OTU dalam FARISA type yang ditemukan secara berulang pada tempe dari
delapan pengrajin. Data ini menunjukkan bahwa komunitas bakteri diduga lebih
diskriminatif menentukan perbedaan karakteristik tempe. Hal ini diperkuat dengan
adanya analisis pustaka gen 16S rRNA dari dua tempe EMP dan SDJD. Analisis
ini menunjukkan bahwa komunitas bakteri yang mendominasi populasi bakteri
pada dua contoh tempe tersebut sangat berbeda. Pada tempe EMP, komunitas
bakteri didominasi oleh bakteri Acetobacter dan Lactobacillus sedangkan pada
tempe SDJD, komunitas bakteri lebih didominasi oleh bakteri Klebsiella dan
Klebsiella yang tidak terkultur. Profil BARISA juga dapat menunjukkan bahwa
isolat Klebsiella dan Bacillus yang terdapat pada tempe secara genetik dapat
berbeda dengan spesies yang bersifat patogen pada manusia (Klebsiella
pneumoniaeATCC35657danBacillus cereus ATCC10876).
6
© Hak Cipta milik IPB, tahun 2012
Hak Cipta dilindungi Undang-Undang
1. Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan
atau menyebutkan sumber.
a. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan
karyailmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau tinjauan suatu
masalah
b. Pengutipan tidak merugikan kepentingan yang wajar IPB.
2. Dilarang mengumumkan atau memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis
dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB
7
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Tuhan atas segala hikmat dan
kebijaksanaan yang telah dilimpahkan bagi penulis sehingga disertasi dengan
judul “Analisis Metagenom Untuk Pencirian Komunitas Bakteri dan Fungi pada
Tempe” ini dapat diselesaikan dengan baik. Bagian dari disertasi ini juga telah
dipublikasikan pada Hayati Journal of Bioscience Vol 19 No 2. Juni 2012 dengan
judul : “Comparison of DNA Extraction Methods for Microbial Community
Analysis in Indonesian Tempe Employing Amplified Ribosomal Intergenic
Spacer Analysis”.
Penelitian ini juga terlaksana atas bantuan berbagai pihak. Untuk itu penulis
sangat berterima kasih kepada berbagai pihak:
1. Para pembimbing: Prof. Dr. Antonius Suwanto, M.Sc., Dr, Iman Rusmana,
M.Si dan Dr. Dedy Duryadi Solihin, DEA atas segala bimbingan dan arahan
yang diberikan selama penelitian dan penulisan disertasi ini dilakukan.
2. Direktorat Jenderal Pendidikan Tinggi Kementerian Pendidikan dan
Kebudayaan atas beasiswa pendidikan BPPS yang penulis terima.
3. Direktorat Penelitian dan Pengabdian kepada Masyarakat Direktorat Jenderal
Pendidikan Tinggi Kementerian Pendidikan dan Kebudayaan atas dana
penelitian yang diberikan melalui penelitian Hibah Strategies Nasional dengan
nomor kontrak 524/SP2H/PP/DP2M/VII/2010, Tanggal 24 Juli 2010 dan
406/SP2H/PL/Dit.Litabmas/IV/2011, Tanggal 14 April 2011.
4. Dekan dan Civitas Akademika Fakultas Teknobiologi Atmajaya Indonesia di
Jakarta atas semua fasilitas laboratorium dan ijin penggunan isolat Klebsiella
pneumoniae ATCC35657 koleksi Fakultas Teknobiologi UNIKA Atmajaya
yang mendukung kelancaran penelitian ini.
5. Para Penguji Luar Komisi: Prof. Dr. Anja Meryandini, Prof. Dr. Suyanto
Pawiroharsono, Prof. Dr. Aris Tri Wahyudi dan Dr. Yuri Sutanto yang
berkenan meluangkan waktu untuk menguji dan memberi masukan demi
perbaikan disertasi ini.
6. Dr. Tati Barus untuk kesediaannya memberikan ijin menggunakan dua isolat
koleksi: Klebsiella 135 danBacillus CR9 pada penelitian ini.
8
7. Arhad Kamahayanikam Vratyastoma dan Alvonsus Alvin atas semua bantuan
dan kebersamaan selama penelitian ini berlangsung di Lab Riset FTB UNIKA
Atmajaya.
8. Ibu Tati, Ibu Yunning, Pak Bambang, Pak Ridwan, Pak Dahrul, Pak Dahni dan
Pak Nurdin atas semua bantuan selama penelitian ini dilakukan.
9. Dr. Nikmans Hatu yang telah membantu pengurusan dana penelitian. Dra.
Cynthia Wattimena, M.Sc. yang telah meluangkan waktu untuk mencari
literatur yang penulis butuhkan. Sanita Suryani, M.Si dan Ibu Lisa Hitalessy-
Telussa atas bantuannya selama penulis melakukan pengambilan sampel.
Handy E.P. Leimena, S.Si., M.Si. atas semua arahannya dalam bidang Ekologi.
Ir. Delly Matruti, M.Si yang selalu bersedia dititipkan sampel sebelum dibawa
ke lab.
10. Teman-teman seangkatan MIK 2008 dan 2009 atas kebersamaannya selama
kuliah.
11. Papa dan Mama (alm), Papa dan Mama mertua (alm) dan semua saudara-
saudara: John, Odie, Ella, Ain, Anes, Ici dan Eten yang selalu memberi
dukungan Doa dan bantuan yang tidak terhingga.
12. Corinus Titihalawa dan Cecilia Daniela Titihalawa, suami dan anak tercinta
atas semua pengorbanan dan dukungannya selama penulis menempuh
pendidikan dan penelitian.
13. Semua pihak yang tidak dapat disebutkan namanya satu persatu yang telah
banyak memberikan kontribusi selama penelitian ini berjalan.
Atas semua kebaikan yang diberikan, penulis mengucapkan terima kasih
yang sebesar-besarnya. Penulis tidak dapat membalas semua kebaikan ini namun
biarlah Tuhan yang empunya segala berkat melimpahkan berkat atas semua
kebaikan yang diberikan.
Bogor, September 2012
Cecilia Anna Seumahu
9
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Malang pada tanggal 19 April 1972 dari ayah Drs.
Johannis Gerzon Seumahu, M.Pd. M.AppSc, dan Ibu Dra. Cecilia Cornelia
Haullussy. Penulis menyelesaikan pendidikan S1 di Jurusan Biologi FMIPA IPB
pada tahun 1997. Pendidikan S2 diselesaikan penulis pada tahun 2005 di Program
studi Bioteknologi Sekolah Pasca Sarjana IPB Bogor dan pada tahun 2008 tercatat
sebagai mahasiswa program S3 di Mayor Mikrobiologi Departemen Biologi
FMIPA IPB.
Pada Tahun 1999, penulis diangkat sebagai tenaga pengajar tetap pada
jurusan pendidikan Biologi FKIP Universitas Pattimura dan pada Tahun 2000,
penulis ditetapkan sebagai staf pengajar tetap pada Jurusan Biologi FMPIA
Universitas Pattimura Ambon hingga saat ini
10
DAFTAR ISI
Halaman
DAFTAR TABEL…………………………………………………………... vii
DAFTAR GAMBAR……………………………………………………….. ix
DAFTAR LAMPIRAN……………………………………………………… xi
PENDAHULUAN
Latar Belakang…………………………………………………………... 1
Perumusan Masalah……………………………………………………... 2
Tujuan Penelitian……………………………………………………….. 3
Manfaat Penelitian………………………………………………………. 3
Kebaruan (Novelty)…………………………………………………………… 3
Hipotesis Penelitian……………………………………………………… 3
Bagan Alir Penelitian…………………………………………………… 4
TINJAUAN PUSTAKA
Proses Fermentasi yang Melibatkan Konsorsium Mikroba………..……. 5
Pentingnya Fingerprinting Komunitas Sebagai Sistem Barcoding pada
Proses Fermentasi…….…………………………………………….…… 6
Teknik Culture-Independent untuk Mempelajari Mikroba yang Terlibat
dalam Suatu Proses Fermentasi Makanan..……………………………… 7
Automated Intergenic Spacer Analysis (ARISA)….……………………. 8
Pustaka Gen 16S rRNA…………………………………………………. 11
Tempe Sebagai Makanan Tradisional yang Kaya Nutrisi………………. 12
METODE PENELITIAN
Tempat dan Waktu Penelitian…………………………………………… 17
Bahan Penelitian………………………………………………………… 17
Pengambilan Sampel…………………………………………………… 17
Penyiapan Sampel……………………………………………………….. 17
Ekstraksi dengan Metode Fermentas DNA Purification Kit
(FDEK)…………………………………………………………………... 18
Ekstraksi dengan Metode Power Food Microbial DNA Isolation Kit
MOBIO (PFMDIK-MOBIO)……………………………………………. 19
Analisis Kuantitas dan Kualitas DNA Hasil Ekstraksi………………….. 19
Analisis Inhibitor PCR………………………………………………….. 20
Analisis Keragaman Komposisi Mikroorganisme………………………. 20
Kloning dan Sequencing Gen 16S rRNA……………………………….. 21
Analisis Isolat Tunggal dengan ARISA……………………………….... 22
HASIL
Optimasi Metode Ekstraksi DNAMikrobadi Tempe………..…………. 23
Analisis Profil ARISATypeTempe dari Sejumlah Produsen Tempe….. 29