alterações na linhagem celular e organização neuronal do giro denteado em dois modelos ...

127 Pages·2017·4.83 MB·English

by  Melek Chouchane

DANIELA MARIA DE SOUSA MOURA

ALTERAÇÕES NA LINHAGEM CELULAR E ORGANIZAÇÃO NEURONAL DO GIRO
DENTEADO EM DOIS MODELOS ANIMAIS DE EPILEPSIA

Natal-RN
2017
Instituto do Cérebro

Universidade Federal do Rio Grande do Norte Programa de Pós-Graduação em Neurociências

Alterações na linhagem celular e organização neuronal do giro denteado em dois modelos
animais de epilepsia

Daniela Maria de Sousa Moura

Tese apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Neurociências da Universidade
Federal do Rio Grande do Norte como requisito
parcial para a obtenção do título de Doutor em
Neurociências.
Orientador: Marcos R. Costa
Co-orientador: Claudio M.T. Queiroz

Natal-RN, Brasil
Agosto de 2017

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Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN
Sistema de Bibliotecas - SISBI
Catalogação de Publicação na Fonte. UFRN - Biblioteca Setorial Árvore do Conhecimento - Instituto do Cérebro - ICE
Moura, Daniela Maria de Sousa.
Alterações na linhagem celular e organização neuronal do giro
denteado em dois modelos animais de epilepsia / Daniela Maria de
Sousa Moura. - Natal, 2017.
127f.: il.

Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Instituto do
Cérebro, Programa de Pós-graduação em Neurociências.
Orientador: Marcos R. Costa.
Coorientador: Claudio M. Queiroz.

1. Neurogênese. 2. Epilepsia. 3. Hipocampo adulto. I. Costa,
Marcos R. II. Queiroz, Claudio M. III. Título.

RN/UF/Biblioteca Setorial Árvore do Conhecimento - Instituto do
Cérebro CDU 616.853

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Agradecimentos

À minha querida família,
Aos grandes e bons amigos Arthur, Bryan, Carol, Daiane, Dudu, Fernanda, Fernanda, Geissy,
Júlia, Juliana, Kelly, Laila, Sérgio;
Aos amigos biólogos da UFPE espalhados pelo mundo, mas sempre presentes;
A todos os membros que passaram e estão no NeuroCell;
Às companheiras do Meninas@Neuro;
Ao corpo docente e discente e indecente do Corujinha University;
A todos que colaboraram direta e indiretamente com este projeto;
Ao Instituto do Cérebro e seus funcionários;
Em especial, a Marcos e a Claudio.
Resumo

As células granulares do hipocampo são um dos poucos tipos de neurônios gerados no
sistema nervoso central de mamíferos adultos. O modelo atual de neurogênese no hipocampo
adulto assume que células tronco neurais (CTN) geram progenitores com potencial restrito à
geração de neurônios ou astrócitos. Estímulos ambientais e condições patológicas podem
alterar a progressão da linhagem, modulando a proliferação, diferenciação, sobrevivência e
integração sináptica dos neurônios gerados. Por exemplo, a Epilepsia do Lobo Temporal mesial
(ELT), a forma mais comum de epilepsia em adultos, está associada a alterações na taxa de
neurogênese hipocampal adulta. Neste trabalho, nós utilizamos dois modelos experimentais de
ELT para avaliar os efeitos de um insulto epileptogênico (i.e., status epilepticus, SE) sobre a
linhagem e amadurecimento celular no giro denteado adulto. Através da técnica de fate-
mapping utilizando animais Dcx-CreERT2/CAG-CAT-GFP, nós acompanhamos o destino de
células que apresentavam o promotor do gene doublecortin (DCX) ativado antes ou depois da
injeção intrahipocampal dos agentes convulsivantes ácido caínico ou pilocarpina. Desta forma,
pudemos avaliar o efeito destas drogas sobre progenitores e neurônios imaturos DCX+ gerados
antes ou após o tratamento. Em ambos os modelos, foram observados um aumento de
neurogênese e alterações no posicionamento e morfologia de células granulares, conforme
descrições prévias na literatura. Alterações neuronais, tais como localização ectópica e
presença de dendritos basais, foram observadas tanto em células geradas antes quanto após a
indução do SE, embora com frequências distintas. No entanto, apenas no hipocampo ipsilateral
à injeção de ácido caínico nós observamos dispersão da camada granular e morte neuronal em
CA1 e CA3, apesar da atividade paroxística epiléptica ocorrer em ambos os hipocampos.
Surpreendentemente, o aumento da neurogênese em animais que receberam ácido caínico foi
restrito ao hipocampo contralateral, enquanto no lado ipsilateral foi observado um significativo
aumento na geração de astrócitos a partir dos progenitores DCX+. Além disso, também
observamos neste modelo a presença de células com morfologia e marcadores de CTNs,
sugerindo que progenitores DCX+ poderiam regredir para estados mais primitivos na linhagem
celular do hipocampo adulto. O aumento da astrogliogênese no lado ipsilateral à injeção de
2
ácido caínico foi associado a uma degeneração de interneurônios parvalbumina (PV)+ no
hipocampo, sugerindo que a atividade gabaérgica poderia estar contribuindo para o
redirecionamento da linhagem celular. Em conjunto, nossos dados indicam que a linhagem
celular no giro denteado não é unidirecional e irreversível, e que o aumento da atividade
elétrica neuronal induzida por ácido caínico e pilocarpina têm efeitos diferentes sobre a
diferenciação celular e destino fenotípico dos progenitores e neurônios nessa região. Esses
resultados impõem a necessidade de revermos o modelo atual de neurogênese hipocampal
adulta e também indicam que diferentes modelos animais de epilepsia produzem alterações
celulares distintas no hipocampo adulto e, portanto, poderiam representar diferentes
graus/estágios da patologia.

Palavras Chaves
Hipocampo adulto, neurogênese, astrogliogênese, epilepsia, ácido caínico, pilocarpina,
interneurônios gabaérgicos, dirpersão das células granulares, neurônios ectópicos, dendritos
basais hilares, camundongo.

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Abstract

The granular cells of the hippocampus are one of the few types of neurons generated in
the central nervous system of adult mammals. The current model of neurogenesis in the adult
hippocampus assumes that neural stem cells (NSCs) give rise to progenitors restricted to the
generation of neurons or astrocytes. Environmental stimuli and pathological conditions can
alter the lineage progression, modulating cell proliferation, differentiation, survival and synaptic
integration of newly generated neurons. For example, mesial Temporal Lobe Epilepsy (TLE), the
most common form of epilepsy in adults, is associated with changes in the rate of adult
hippocampal neurogenesis. In this work, we used two experimental TLE models to evaluate the
effects of an epileptogenic insult (i.e., status epilepticus, SE) on the cell lineage and neuronal
maturation in the adult dentate gyrus. Using Dcx-CreERT2 / CAG-CAT-GFP animals, we fate
mapped the fate of cells expressing the doublecortin gene (DCX) either before or after
intrahippocampal injection of the convulsive agents kainic acid or pilocarpine. In this way, we
could evaluate the effect of these drugs on DCX+ progenitors and immature neurons generated
before or after treatment. In both models, we observed an increase in neurogenesis and
changes in the positioning and morphology of granular cells, according to previous descriptions
in the literature. Neuronal aberrations, such as ectopic localization and presence of basal
dendrites, were observed both in cells generated before and after induction of SE, albeit at
different frequencies. However, only in the hippocampus ipsilateral to the injection of kainic
acid we observed granule cell dispersion and neuronal death in CA1 and CA3, although the
paroxysmal epileptic activity occurred in both hippocampi. Surprisingly, the increase in
neurogenesis in animals that received kainic acid was restricted to the contralateral
hippocampus, whereas on the ipsilateral side a significant increase in astrocyte generation was
observed within the DCX+ progenitor lineage. In addition, we also observed the presence of
cells with NSC hallmarks, suggesting that DCX+ progenitors could regress to more primitive
states in the adult hippocampal cell lineage. The increased astrogliogenesis on the ipsilateral
side to the injection of kainic acid was associated with a degeneration of parvalbumin (PV)+
interneurons in the hippocampus, suggesting that GABAergic activity could be contributing to
4
the rerouting of the DCX+ progenitor cell lineage. Taken together, our data indicates that the
cell lineage in the dentate gyrus is neither unidirectional nor irreversible, and that the increased
neuronal electrical activity induced by kainic acid and pilocarpine have different effects on cell
differentiation, as well as on the fate of progenitors and neurons in that region. These results
highlight the need to review the current model of adult hippocampal neurogenesis and also
indicate that different animal models of epilepsy produce distinct cellular alterations in the
adult hippocampus and could therefore represent different degrees / stages of the pathology.

Keywords
Adult hippocampus; neurogenesis; astrogliogenesis; epilepsy; fate-specification; kainic
acid; pilocarpine; GABAergic interneurons; granule cell dispersion; ectopic neurons; hilar basal
dendrites, mouse.

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Sumário

Resumo ......................................................................................................................................................... 2
Abstract ......................................................................................................................................................... 4
Sumário ......................................................................................................................................................... 6
Lista de Abreviações ..................................................................................................................................... 8
Capítulo 1 ...................................................................................................................................................... 9
Considerações iniciais ............................................................................................................................. 10
1.1 Hipocampo ........................................................................................................................................ 11
Circuito neuronal do hipocampo ........................................................................................................ 13
1.2 Neurogênese adulta .......................................................................................................................... 16
Diferenciação dos novos neurônios .................................................................................................... 22
Relevância funcional dos novos neurônios ......................................................................................... 27
Regulação da neurogênese ................................................................................................................. 30
1.3 Epilepsia ............................................................................................................................................ 35
Epileptogênese .................................................................................................................................... 36
Modelos animais de ELT ..................................................................................................................... 39
Neurogênese e epilepsia ..................................................................................................................... 40
Objetivos ................................................................................................................................................. 43
Objetivos específicos .............................................................................................................................. 43
Resultados ............................................................................................................................................... 44
Capítulo 2 .................................................................................................................................................... 45
Abstract ................................................................................................................................................... 46
Introduction ............................................................................................................................................ 47
Results ..................................................................................................................................................... 48
Dcx-lineage in the adult hippocampus encompasses astrocytes ....................................................... 48
Kainic acid enhances astrogliogenesis in the DCX-lineage ................................................................. 52
Progenitors within the Dcx-lineage are still active one month after recombination ......................... 55
Dcx-expressing progenitors can reverse to multipotent stages ......................................................... 57
Increased electrical activity is not sufficient to induce astrogliogenesis from Dcx-expressing
progenitors .......................................................................................................................................... 59
Loss of parvalbumin-expressing interneurons correlates with increased astrogliogenesis ............... 61
Discussion................................................................................................................................................ 63
6
Supplementary Material ......................................................................................................................... 68
Methods .................................................................................................................................................. 73
Capítulo 3 .................................................................................................................................................... 76
Abstract ................................................................................................................................................... 77
Introduction ............................................................................................................................................ 78
Results ..................................................................................................................................................... 79
Intrahippocampal administration of both kainic acid and pilocarpine lead to bilateral epileptiform
activity, status epilepticus and spontaneous seizures ........................................................................ 79
Mature granule cells exhibit abnormalities in ipsilateral and contralateral hippocampi ................... 81
Neurogenesis is selectively suppressed in the kainic acid-injected hippocampus ............................. 83
Electric activity is not sufficient to promote GCD and newborn cell abnormalities. .......................... 85
Discussion................................................................................................................................................ 87
Methods .................................................................................................................................................. 89
Capítulo 4 .................................................................................................................................................... 92
Discussão Geral ....................................................................................................................................... 92
Alterações na linhagem celular ............................................................................................................... 93
Alterações neuronais nos dois modelos de epilepsia ........................................................................... 101
Conclusões ............................................................................................................................................ 105
Anexo ........................................................................................................................................................ 106
Referências ................................................................................................................................................ 107

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