Alexandre OLRY Mécanisme et spécificité structurale des Méthionine sulfoxyde réductases

234 Pages·2005·22.54 MB·French

FACULTE DES SCIENCES & TECHNIQUES

U.F.R Sciences et Techniques Biologiques
Ecole Doctorale Biologie, Santé et Environnement

Thèse

Présentée pour l’obtention du titre de

Docteur de l’Université Henri Poincaré, Nancy I

en Enzymologie Moléculaire

par Alexandre OLRY

Mécanisme et spécificité structurale des
Méthionine sulfoxyde réductases (Msr) de
Neisseria meningitidis et rôle
du métal dans les MsrB

Soutenue publiquement le 13 Avril 2005

Membres du jury :
Rapporteurs : M. B. Friguet Professeur, Université Denis Diderot, Paris VII
M. V. Nivière Directeur de Recherches au CNRS, Grenoble I

Examinateurs : M. M. T. Cung Directeur de Recherches au CNRS, INPL
Mme. S. Boschi-Muller Maître de Conférences, Université Henri Poincaré, Nancy I
M. G. Branlant Professeur, Université Henri Poincaré, Nancy I

Président du jury : M. J. P. Jacquot Professeur, Université Henri Poincaré, Nancy I

Laboratoire de Maturation des ARN et Enzymologie Moléculaire UMR CNRS-UHP 7567
Faculté des Sciences & Techniques - BP 239 - 54506 Vandoeuvre-lès-Nancy Cedex

J’exprime ma sincère reconnaissance à Mme le Dr. Christiane Branlant,
Directeur de l’UMR 7567 CNRS-UHP pour m’avoir accueilli dans son laboratoire.

Je tiens à remercier tout particulièrement Mr le Pr. Guy Branlant, responsable
de l’équipe Enzymologie Moléculaire, qui a dirigé ce travail. Je le remercie pour
m’avoir encadré tout au long de ma thèse mais aussi lors de mon D.E.A. Grâce à ses
conseils avisés, j’ai pu mener à bien mon projet de la meilleure des manières. Grâce à
sa grande culture scientifique, sa curiosité, sa rigueur qu’il m’a en partie transmises
je lui suis reconnaissant et je le remercie profondément. Merci pour m’avoir impliqué
dans de nombreuses collaborations et m’avoir ainsi permis d’acquérir une culture
scientifique très large.

Mes reconnaissances s’adressent également à Mme le Dr. Sandrine Boschi-
Muller, Maître de conférences dans l’équipe Enzymologie Moléculaire qui m’a co-
encadré depuis mon arrivée au laboratoire. Merci pour son soutien durant ces quatre
années passées au laboratoire ainsi que pour ses conseils avisés. Je lui suis très
reconnaissant pour son aide quant à la rédaction de mon manuscrit de thèse. Je lui
souhaite sincèrement de mener du mieux possible sa carrière scientifique.

Mes remerciements s’adressent aussi au Dr. Vincent Nivière, Directeur de
Recherches au CNRS et au Pr. Bertrand Friguet qui me font l’honneur de juger mon
travail en tant que rapporteurs. Merci également au Dr. Mahn Thong Cung, Directeur
de Recherches au CNRS et au Pr. Jean-Pierre Jacquot d’avoir accepté de participer à
mon jury de thèse.

Merci à toutes les personnes qui ont collaboré sur ma thématique et partagé
avec moi de nombreuses discussions scientifiques enrichissantes: Mr le Pr. Daniel
Burnel du laboratoire de Toxicologie des Métaux, UHP Nancy I; Guillaume Chevreux
et le Dr. Sarah Sanglier du Laboratoire de Spectrométrie de Masse Bio-orgnique
UMR 7509 CNRS-ULP, Strasbourg; le Dr. Brice Kauffmann, le Dr. Frédérique tête-
Favier et Moutsé Rainaivoson de l’équipe Bio-Cristallographie UMR 7036 CNRS-
UHP, Nancy I; le Dr. Benjamin Ezraty et Julia Bos du Laboratoire de Chimie
Bactérienne UPR-CNRS 9043, Marseille; le Dr. Bulent Balta du Laboratoire de
Chimie et Biochimie Théorique UMR 7565 SRSMC, Nancy I.
Je remercie chaleureusement mes amis Aurélien et Nico les deux RMNistes du
Laboratoire de Chimie Physique Macromoléculaire UMR 7568 CNRS-INPL, ENSIC.
Je n’oublierai jamais toute l’amitié qu’ils m’ont donnée en dehors du travail. Des
personnes comme eux on en a besoin.

Beaucoup de personnes du laboratoire me sont chères. Je pense en particulier à
mes amis Christophe, un mec bien, Séverine toujours à l’écoute, Jimmy le foufou,
Fabrice.
Je n’oublie pas non plus les nombreuses autres personnes que j’estime
beaucoup : Jacky la plus gentille des mamans, les 2 François, Fred le samouraï,
Arnaud, Christophe J, Denise, Corinne, Benoit, Seve, Karine, Bruno, Alex K Seb, Val,
Antoine, Florence, Xav et Xav, Allan, Houda, Mathias, Adeline, Athanase, Virginie,
Fabrice, Lionel, Sophie, Hong et Junzhu…

Merci à tous mes amis de l’ENSAIA: Ben je t’adore, David, Romain, Seb,
Sandrine, Reine, Fred le cous je t’accorde une dédicace spéciale pour tous les
moments partagés … pour leurs conseils, leurs encouragements. On en a passé des
moments à discuter et à rigoler.

Cette thèse, je la dédie à ma famille que j’adore maman, papa, charly, mon
lolo, mes grand-parents. Leur soutien m’a été indispensable, merci pour leurs
encouragements, leur écoute.

Voilà maintenant c’est à moi de jouer…. Je pense à tous ceux qui m’estiment
pour ce que je suis et qui pensent que je leur ai apporté ne serait-ce qu’un rien.
Sommaire
SOMMAIRE

■ Etude bibliographique

PARTIE I : LES MOLECULES DU STRESS OXYDANT 1

I : Chimie et source cellulaire des FAO 1

I. 1. Le dioxygène (O ) 1
2
I. 2. L’oxygène singulet (O *) 3
2
I. 3. L’ozone (O ) 4
3
I. 4. Les produits de réduction du dioxygène 4
I. 4. 1. L’anion superoxyde 5
I. 4. 2. Le peroxyde d’hydrogène 6
I. 4. 3. Le radical hydroxyle 6
I. 5. Les entités nitrées réactives 7
I. 5. 1. L’oxyde nitrique (NO.) 7
I. 5. 2. Le peroxynitrite 7
I. 6. Les entités halogénées réactives : les acides hypohalogénés 8

II. Systèmes d’élimination des FAO 9

II. 1. Les systèmes enzymatiques 11
II. 1. 1. Elimination de l’anion superoxyde 11
II. 1. 1. 1. Les superoxyde dismutases 11
II. 1. 1. 2. Les superoxyde réductases (SOR) 13
II. 1. 2. Elimination du peroxyde d’hydrogène : les peroxydases 14
II. 1. 2. 1. Les peroxydases hémiques 14
II. 1. 2. 1. α. Catalase/Catalase peroxydase 14
II. 1. 2. 1. β. Autres peroxydases hémiques 15
II. 1. 2. 2 Les peroxydases non hémiques 16
II. 1. 2. 2. α. Les glutathion peroxydases 16
II. 1. 2. 2. β. Les peroxyrédoxines (Prx) 17
II. 1. 2. 2. γ. NADH peroxydase 18
II. 1. 3. L’oxydase hémique (HO) 20
II. 1. 4. Les protéines de choc thermique (Hsp) 20
II. 1. 5. La thiorédoxine (Trx) 21
II. 1. 6. Régulation intracellulaire de la concentration en fer libre 22
II. 1. 6. 1. Internalisation via les recepteurs à transferrines 22
II. 1. 6. 2. Stockage dans les ferritines 22
II. 2. Les systèmes non enzymatiques 23
II. 2. 1. L’acide α-lipoïque (AL) et
l’acide dihydrolipoïque (DHLA) 23
II. 2. 2. Le glutathion (GSH) 24
Sommaire

II. 2. 3. Les vitamines C et E 25
II. 2. 4. Les flavonoïdes 26
II. 2. 5. Les caroténoïdes 27
II. 2. 6. L’ubiquinone (coenzyme Q) 28

III. FAO et Signalisation cellulaire : activation des voies de
signalisation via l’oxydation de Cys et la formation
de ponts disulfures 29

III. 1. Les systèmes OxyR et SoxR/S chez E. coli 29
III. 1. 1. OxyR 29
III. 1. 2. SoxR/S 30
III. 2. Les protéines phosphatases chez les eucaryotes 30

IV. Action des FAO sur les biomolécules et réparation des
dommages causés par les FAO 32

IV. 1. Action sur l’ADN et réparation 32
IV. 2. Action sur les lipides et réparation 32
IV. 3. Action sur les protéines et réparation 33
IV. 3. 1. Altération de la chaîne principale 33
IV. 3. 2. Altération de la chaîne latérale 33
IV. 3. 2. 1. Résidus aliphatiques 33
IV. 3. 2. 2. Résidus aromatiques 34
IV. 3. 2. 3. Résidus soufrés 34
IV. 3. 3. Altération des centres Fe/S 35
IV. 3. 4. Réparation des protéines 36

PARTIE II : Oxydation des Met dans les protéines,
conséquences et réparation par les Msr 37

I. Introduction 37

II. Réaction de la Met avec les FAO 38

III. Conséquences de l’oxydation des Met
en MetSO dans les protéines 39

III. 1. Première étape vers une voie de dégradation des protéines 39
III. 2. Modulation de la fonction des protéines 41
III. 2. 1. Les canaux ioniques 41
III. 2. 2. L’α-synucléine : implication dans la maladie
de Parkinson 42
III. 2. 3. Les inhibiteurs de protéase 43
III. 2. 4. Autres exemples de modulation de l’activité 43
Sommaire
III. 3. Rôle antioxydant 45

IV. Rôle physiologique des Msr 45

IV. 1. Rôle de réparation et de régulation 46
IV. 1. 1. La protéine ribosomale L12 46
IV. 1. 2. Les canaux ioniques 46
IV. 1. 3. L’apolipoprotéine A-I 46
IV. 1. 4. La protéase de HIV-II 47
IV. 1. 5. Les protéines de choc thermique (Hsp) 47
IV. 1. 6. La protéine Ffh, composante de la particule
de reconnaissance SRP 48
IV. 1. 7. L’inhibiteur de protéase plasminogène 48
IV. 1. 8. La protéine chaperone GroEL 49
IV. 2. Résistance au stress oxydant 49
IV. 3. Rôle dans la virulence des bactéries pathogènes 50
IV. 3. 1. Les MsrA : enzymes impliquées dans l’interaction
hôte-pathogène ? 50
IV. 3. 2. Rôle dans la résistance à un stress généré par
la cellule hôte 51
IV. 4 Implication dans le vieillissement cellulaire et dans
les pathologies humaines 52
IV. 4. 1 Les Msr : des enzymes « anti-âge » 52
IV. 4. 2 Les maladies humaines 53

V. Distribution tissulaire et localisation subcellulaire des Msr 54

V. 1. Distribution tissulaire 54
V. 2. Localisation subcellulaire 55

VI. Propriétés des MsrA et des MsrB 57

VI. 1. Spécificité de substrat 57
VI. 2. Mécanisme catalytique 58
VI. 3. Structure tridimensionnelle 58
VI. 3. 1. MsrA 60
VI. 3. 1. MsrB 63
VI. 4. Sous-classes de Msr 66
VI. 4. 1. MsrA 66
VI. 4. 2. MsrB 68

VII. Organisation génomique des Msr 70

VII. 1. Chez les bactéries 70
VII. 2. Chez les archae 71
VII. 3. Chez les eucaryotes 71

■ Objectifs
73
Sommaire

■ Résultats

PARTIE I : Mécanisme catalytique et stéréospécificité des Msr
de PilB de N. meningitidis 75

I. Mécanisme catalytique des Msr de N. meningitidis 76

II. Spécificité de substrat des Msr de N. meningitidis 77

III. Publication no 1 80

PARTIE II : Caractérisation du mécanisme cinétique et des trois
étapes du mécanisme catalytique de la MsrB
de N. meningitidis 87

I. Le mécanisme cinétique de la MsrB de N. meningitidis
est de type ping-pong 87

I. 1. Résultats cinétiques 87
I. 2 Discussion 89

II. Détermination de la vitesse des trois étapes du mécanisme 90

II. 1. Etape 1 de réduction du substrat sulfoxyde 91
II. 2. Etape 2 de formation du pont disulfure Cys117-Cys63 91
II. 3. Etape 3 de réduction du pont disulfure
Cys117-Cys63 par la Trx 92

III. Publication no 2 94

PARTIE III : Acides aminés impliqués dans la première
étape du mécanisme catalytique des MsrB 101

I. Détermination des pKa des Cys117 et Cys63 catalytiques
dans l’enzyme libre 101

II. Détermination des pK des résidus impliqués dans la catalyse
app
de l’étape réductase 102

III. Conclusion 104

PARTIE IV : Etude de l’interaction MsrB-Trx 105