Table Of ContentПРОГРАММНОЕ ОБЕСПЕЧЕНИЕ
Agilent ChemStation
ДЛЯ ТРЕХМЕРНЫХ СИСТЕМ СБОРА ДАННЫХ С
ЖИДКОСТНОГО ХРОМАТОГРАФА
ИНСТРУКЦИЯ ПО ОСВОЕНИЮ ЧАСТИ ПРОГРАММНОГО
ОБЕСПЕЧЕНИЯ, СПОСОБСТВУЮЩЕЙ ОБРАБОТКЕ
СПЕКТРАЛЬНОЙ ИНФОРМАЦИИ
Каталожный номер: G2180-90006
Редакция: 06/03
2
Документ издан в Германии
Авторское право фирмы Agilent Technologies на данный документ зарегистрировано в 2003
году.
Никакая часть этого документа не подлежит заимствованию, копированию или
воспроизведению в любом виде и любыми средствами (включая ксерокопирование, запись в
электронную память, использование в поисковых системах или перевод) без получения на то
письменного разрешения фирмы Agilent Technologies Inc. (за исключением случаев,
предусмотренных международными Законами об авторских правах).
"Microsoft" - торговая марка, зарегистрированная фирмой "Microsoft Corporation"
Этот документ соответствует вариантам A.10.xx программного обеспечения Agilent
ChemStation (где xx – числа, отображающие небольшие изменения программного
обеспечения и не влияющие на пригодность документации).
Гарантийные обязательства
Информация, приведенная в данном документе, может меняться (при последующих
переизданиях) без уведомления. Кроме того, в максимальной степени (дозволенной
действующим законом), фирма Agilent не несет никаких гарантийных обязательств по
излагаемому материалу, включая гарантийные обязательства по пригодности к перепродаже
и по пригодности для конкретных целей (отказ от гарантийных обязательств не
ограничивается теми, которые названы выше). Фирма Agilent не несет ответственности за
допущенные в данном документе ошибки, за случайные или последственные повреждения,
связанные с качеством этого документа или пользованием документом. Если же фирма
Agilent и покупатель заключили специальное письменное соглашение о гарантийных
обязательствах, касающихся данного документа (и если эти обязательства противоречат
сделанным выше оговоркам), действующими становятся формулировки такого
подписанного соглашения.
Лицензирование технических решений
Аппаратурная оснастка и (или) программное обеспечение, описанные в этом документе,
защищены лицензией. Могут использоваться или копироваться только при соблюдении
условий, сформулированных в тексте этой лицензии.
3
Предупреждения и предостережения об опасных ситуациях
Предостережения
ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ предупреждает об опасности; обращает внимание на процедуру,
способ работы и т.д., которые (при неправильном выполнении и при отступлении от
указаний) могут привести к повреждению прибора или к потере важных данных. Не
выполняйте действия, указанные за ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕМ, до тех пор, пока его смысл не
будет полностью осознан.
ПРЕДУПРЕЖДЕНИЕ предостерегает об опасности; обращает внимание на процедуру,
способ работы и т.д., которые (при неправильном выполнении и при отступлении от
указаний) могут привести к получению травмы или к смертельному исходу. Не выполняйте
действия, указанные за ПРЕДУПРЕЖДЕНИЕМ, до тех пор, пока его смысл не будет
полностью осознан.
Сведения о данном документе
В данном документе описаны различные функции, реализуемые вариантом A.10.xx той
части программного обеспечения Agilent ChemStation, которая способствует обработке
спектральной информации. Фактически, этот материал дополняет сведения, изложенные в
Инструкции по освоению системы обработки данных Agilent ChemStation. Рассматриваемые
вопросы применимы к следующим вариантам систем: система Agilent ChemStation для
жидкостного хроматографа; система Agilent ChemStation для капиллярного электрофореза;
система Agilent ChemStation для LC-MSD (в той части, которая соответствует обработке
спектральных данных, зарегистрированных детектором с диодной матрицей).
Для получения подробной информации по загрузке части программного обеспечения,
способствующей обработке спектральной информации, и по указанию конфигурации, см.
Инструкцию по загрузке программного обеспечения ChemStation.
Раздел 1. Освоение спектрального анализа
В этом разделе рассматриваются следующие темы:
• Что представляет собой спектральный анализ?
• Определение оптимальной длины волны, используемой для обнаружения
• Виды сообщений спектральных данных
4
Раздел 2. Спектральные библиотеки
Обычные системы обработки данных подсчитывают количество веществ, опознанных по
времени удерживания (времени миграции). Такой подход может приводить к ошибкам, если
• В обозначенное поле допуска по времени удерживания (времени миграции) попадают
какие-то посторонние (непрокалиброванные) вещества
• В такое поле допуска попадают несколько пиков
• Время удерживания (время миграции) вещества оказывается больше обозначенного
полем допуска (из-за того, что изменилась скорость протока подвижной фазы или, что
наблюдается более часто, изменились характеристики колонки [капилляра])
Одним из способов избежания таких ошибок является использование подтверждающих
пиков (описанное в Инструкции по освоению системы обработки данных Agilent
ChemStation).
При работе с детектором с диодной матрицей, такие ошибки могут быть устранены за счет
подтверждения правильности опознания пиков по спектрограммам. Справочные
спектрограммы стандартов, полученные при разделении эталонного образца при хорошо
подобранных хроматографических (электрофоретических) условиях, хранятся в банке
данных (в спектральной библиотеке). При анализе любого исследуемого образца, вы можете
сравнить спектрограммы пиков с теми, которые записаны в одну или несколько библиотек.
Спектрограммы могут быть совмещены для наглядности сопоставления (после чего можно
будет подсчитать степень сродства спектрограмм стандарта и пиков образца).
Система ChemStation может автоматизировать этот процесс для оценки всех пиков на
хроматограмме [электрофореграмме] (и даже для всех хроматограмм [электрофореграмм],
собранных при выполнении программы анализов). Помимо такого подтверждения
правильности опознания пиков, программное обеспечение может помочь проверить чистоту
пиков (для чего задают соответствующие параметры в секторе Purity Preferences
[предпочтительные параметры для проверки чистоты], используемом в режиме диалога).
Результаты такого качественного анализа могут быть объединены с результатами
количественного анализа в одном и том же распечатываемом сообщении, в котором
приводятся все сведения о каждом обнаруженном пике, требуемые исследователю, включая:
• Название вещества
• Количество
• Время удерживания (время миграции)
• Способствующий опознанию коэффициент совпадения
5
• Коэффициент совпадения, используемый при оценке чистоты
В этом разделе описывается принцип библиотечного поиска. Для получения подробных
указаний по выполнению библиотечного поиска, см. подсказывающую информацию,
выводимую на экран в ответ на запрос помощи (Help), и загруженную в вычислительную
машину программу-самоучитель.
Раздел 3. Оценка чистоты пика
В этом разделе описана оценка чистоты пика при пользовании разными вариантами
программного обеспечения ChemStation: вариантом A.04.0x или ранее существовавшими
вариантами; вариантами A.05.0x или более поздними вариантами.
С О Д Е Р Ж А Н И Е
Раздел 1. Освоение методов спектрального анализа...............................................................7
Что представляет собой спектральный анализ?.........................................................................7
Определение оптимальной длины волны, используемой для обнаружения...........................8
Виды сообщений спектральных данных..................................................................................10
Раздел 2. Спектральные библиотеки........................................................................................12
Режимы поиска............................................................................................................................12
Описание сообщения результатов.............................................................................................14
Маркеры, соответствующие проверке чистоты...................................................................15
Маркер качества совпадения, отмеченного при библиотечном поиске............................15
Маркеры, используемые при указании названий веществ.................................................15
Маркеры, используемые при указании количеств ..............................................................16
Раздел 3. Оценка чистоты пика.................................................................................................16
Проверка чистоты пика (при пользовании вариантом A.04.0x программного
обеспечения или ранее существовавшими вариантами).........................................................16
Проверка чистоты пика..............................................................................................................16
Как производится проверка чистоты пика?.........................................................................17
Показатель качества совпадения...........................................................................................17
Подходы к проверке чистоты пика.......................................................................................19
Первый способ проверки чистоты пика: нормализация спектрограмм................................20
Вычитание фона благодаря выбору контрольной спектрограммы....................................21
Второй способ проверки чистоты пика: получение карты отношений.................................23
Пользование графиком отношений сигналов для оценки чистоты пика..........................23
Картина отношений................................................................................................................24
Третий способ проверки чистоты пика: графики спектрального сродства..........................24
Показ отношения графика спектрального сродства к порогу............................................26
Пользование специфичной целевой спектрограммой.........................................................26
Вычисления, соответствующие проверке чистоты.................................................................27
Если графиком спектрального сродства не пользуются.....................................................28
График спектрального сродства используется....................................................................29
6
Графиком порога пользуются (Include Threshold Curve)....................................................30
Классификация пика: чистый или загрязненный................................................................31
Представление данных в окне с показываемым пиком......................................................32
Графики порога...........................................................................................................................33
Пользование анализом чистоты пика.......................................................................................35
Снятие спектрограмм.............................................................................................................35
Выбор параметров, необходимых для проверки чистоты..................................................36
Выбор вариантов, соответствующих усовершенствованной проверке чистоты
(Advanced Purity Options).......................................................................................................38
Более детальное исследование загрязненных пиков...........................................................41
Получение ошибочных результатов при проверке чистоты..............................................42
Рекомендуемый выбор параметров...........................................................................................44
Пример 1: регистрация всех спектрограмм или только всех спектрограмм в
пределах пика (с показом графиков спектрального сродства); автоматический
режим.......................................................................................................................................44
Пример 2: регистрация всех спектрограмм в пределах пика (с показом графиков
спектрального сродства); расшифровка при управлении работой системы вручную.....47
Пример 3: регистрация всех спектрограмм в пределах пика (без показа графиков
спектрального сродства)........................................................................................................49
Пример 4: спектрограммы, автоматически регистрируемые в конкретных точках
пика...........................................................................................................................................51
Проверка чистоты пика (при пользовании вариантом A.05.0x или более новым
программного обеспечения)......................................................................................................54
Проверка чистоты пика..............................................................................................................54
Как производится проверка чистоты пика?.........................................................................54
Показатель качества совпадения...........................................................................................55
Вычитание фона благодаря выбору контрольной спектрограммы....................................57
Подходы к проверке чистоты пика.......................................................................................58
Показ результатов проверки чистоты пика на экране.............................................................59
Сектор со спектральной информацией (Spectra).................................................................59
Нормализация спектрограмм.................................................................................................59
Сектор, используемый для оценки спектральной чистоты (Purity)...................................60
Графики спектрального сродства..........................................................................................61
График порога.........................................................................................................................62
Пользование специфичной целевой спектрограммой.........................................................63
Вычисления, соответствующие проверке чистоты, и вывод результатов на экран.........65
Классификация пика: чистый или загрязненный................................................................66
Информация о чистоте пика..................................................................................................66
Выбор вариантов, соответствующих усовершенствованной проверке чистоты..............68
Пользование анализом чистоты пика.......................................................................................70
Регистрация спектрограмм....................................................................................................70
Выбор параметров, необходимых для проверки чистоты..................................................71
Проверка чистоты пика, зарегистрированного масс-селективным детектором...................73
Подсчет масс-спектральной чистоты....................................................................................74
Вывод сведений о масс-спектральной чистоте на экран....................................................76
7
Раздел 1. Освоение методов спектрального анализа
Что представляет собой спектральный анализ?
Спектральный анализ дает возможность приобретать спектральные данные (с помощью
детектора с диодной матрицей или флуориметрического детектора).
Анализ спектральных данных добавляет третий вид информации к результатам анализа
(когда используется совместно с данными, накопленными в ходе хроматографической
разгонки [или в ходе разделения системой для капиллярного электрофореза]).
Рис. 1. Спектральная информация
Спектрофотометрический детектор с диодной матрицей
Детектор с диодной матрицей дает возможность непрерывно регистрировать спектрограммы
в ультрафиолетовой и видимой областях спектра, поскольку сигнал обо всех длинах волн
регистрируется фактически одновременно (и без потерь спектральной чувствительности во
время сбора данных).
8
Флуориметрический детектор
Флуориметрический детектор позволяет приобретать спектральные данные в трех
различных режимах:
• можно настроить детектор на неизменную возбуждающую длину волны и
регистрировать спектры возбужденных длин волн
• можно настроить детектор на неизменную возбужденную длину волны и регистрировать
спектры возбуждающих длин волн
• можно собирать данные в режиме 3-мерной регистрации флуоресценции (при изменении
возбуждающих и возбужденных длин волн)
Спектрограммы возбуждающего и возбужденного света могут сниматься непосредственно
во время хроматографического разделения. Однако, поскольку флуориметрический детектор
является сканирующим, чем шире диапазон сканирования, тем ниже чувствительность
анализа. Трехмерная регистрация флуоресценции должна производиться после остановки
потока или при замене проточной кюветы той кюветой, которая типична для обычного
спектрофлуориметра (поскольку необходимо, чтобы во время такой регистрации
концентрация образца в кювете была постоянной).
Обработка спектральных данных
Вы можете обрабатывать данные пользуясь разными способами. Например:
• Извлечение хроматографических (электрофоретических) сигналов из спектральных
данных (для определения оптимальной длины волны для обнаружения каждого пика)
• Проведение поиска в спектральной библиотеке (ради качественного опознания веществ)
• Подсчет отношений хроматографических (электрофоретических) сигналов для
определения чистоты пика
• Проверка чистоты пика (для выявления замаскированных примесей)
Определение оптимальной длины волны, используемой для обнаружения
Во время разработки метода (после того, как подобраны подходящие условия разделения
пиков) приходится подбирать длины волн, оптимальные для обнаружения каждого пика.
9
Одним из способов решения этой задачи является представление данных о поглощении
света (или люминесценции в случае работы с флуориметрическим детектором), длинах волн
и времени в виде топографической карты. При этом спектральная информация
регистрируется в виде концентрических линий (каждая из которых соответствует
конкретному уровню абсорбции или люминесценции) в плоскости, ограниченной шкалами
длины волн и времени (за счет этого, удается регистрировать и оценивать все 3 параметра).
См. центральную часть рисунка 2.
Рис. 2. Топографическое представление абсорбции
Такой подход выгоден при разработке метода (когда необходимо подобрать длины волн,
оптимальные для обнаружения каждого пика). При топографическом представлении
абсорбции (люминесценции), длина волны определяется горизонтальным положением
указателя. По мере перемещения указателя (представленного горизонтальной линией) вдоль
оси длин волн, перестроенная (соответствующая данному положению указателя)
хроматограмма (электрофореграмма) показывается в нижнем окне (см. рис. 2).
Для нахождения длины волы, оптимальной для обнаружения пика, необходимо сделать
следующее:
• Выберите функцию Quick View (быстрый просмотр) из перечня, вызываемого через
слово Cursor (указатель). Перемещайте указатель в центральной части окна для
отыскания уровня, соответствующего наибольшей высоте интересующего пика
(наибольшей абсорбции или люминесценции) при сохранении достаточно четкого
хроматографического (электрофоретического) разделения (показываемого в нижней
части окна).
10
• Выберите функцию Signal (просмотр хроматограммы [электрофореграммы]) из перечня,
вызываемого через слово Cursor (указатель). Подбирайте оптимальную ширину полосы
(ради увеличения отношения сигнала к шуму), соответствующую оптимальной длине
волны. Хроматограмма (электрофореграмма), зарегистрированная при указанной ширине
полосы, может быть перенесена в окно под хроматограмму (электрофореграмму) в поле
изображения, соответствующем анализу данных. Для этого, нужно установить указатель
на клавишу Copy (копирование) и нажать левую клавишу мыши. После переноса,
хроматограмма [электрофореграмма] (с выбранной шириной полосы) может быть
проинтегрирована, использована для идентификации и количественного подсчета (т.е.
можно проверить, не удается ли добиться лучших условий интегрирования, опознания
веществ и количественного анализа при изменении ширины полосы).
Для нахождения длины волы, оптимальной для обнаружения пика флуориметрическим
детектором, обычно требуются две хроматографических разгонки:
• Сперва, устанавливают возбуждающую длину волны (таким образом, чтобы она
попадала в коротковолновую часть ультрафиолетовой области спектра: от 230 до 250 нм)
и регистрируют спектры возбужденного света. Для каждого пика хроматограммы по
топографической карте определяют оптимальную возбужденную длину волны.
• Затем, с помощью таблицы программируемых по времени событий задают оптимальные
возбужденные длины волн для каждого пика; после этого, регистрируют спектры
возбуждающего света.
Трехмерная регистрация флуоресценции
Такие картины флуоресценции показывают спектрограммы, накопленные только в ходе
сканирований. В этом случае, спектральная информация показывается только в
пространстве, отображающем зависимость возбужденных длин волн от возбуждающих длин
волн. Шкалы времени нет, поскольку 3-мерную регистрацию можно проводить только при
остановленном потоке или при помещении образца в кювету, типичную для обычного
спектрофлуориметра. Из топографических карт вы можете извлечь спектры возбуждающего
или возбужденного света на любой длине волны. Спектры возбуждающего света
показываются в верхней части экрана (над топографической картой); соответствуют
вертикальной черте указателя; спектры возбужденного света - в нижней части экрана (под
топографической картой); соответствуют горизонтальной черте указателя.
Виды сообщений спектральных данных
При пользовании вспомогательной частью программного обеспечения, соответствующего
обработке спектральной информации, можно получать следующие варианты сообщений
результатов:
