Àcids nucleics químicament modificats amb potencial terapèutic: oligonucleòtids cíclics i àcids

223 Pages·2003·2.11 MB·Spanish

UNIVERSITAT DE BARCELONA
FACULTAT DE QUÍMICA
DEPARTAMENT DE QUÍMICA ORGÀNICA

Tesi doctoral presentada per En/Na

Cristina AUSÍN MORENO

amb el títol

"Àcids nucleics químicament modificats amb
potencial terapèutic:
oligonucleòtids cíclics i àcids nucleics peptídics
amb abraçadores de guanina"

per a l'obtenció del títol de Doctor/a en

QUÍMICA

Barcelona, 22 d’octubre de 2003.
ÍNDEX I ABREVIATURES

Abreviatures 5

INTRODUCCIÓ I OBJECTIUS 7

1. Oligonucleòtids com a agents terapèutics 9

2. Teràpia antisentit 10
2.1. Introducció històrica 10
2.2. Mecanismes d’acció dels oligonucleòtids antisentit 11
2.2.1. Inhibició de la traducció per bloqueig estèric 11
2.2.2. Mecanisme de la RNasa H 11
2.3. Oligonucleòtids en fases clíniques d’estudi 12
2.4. Propietats dels oligonucleòtids antisentit 13

3. Modificacions químiques dels oligonucleòtids 15
3.1. Modificacions dels enllaços internucleosídics 16
3.1.1. Derivats de fòsfor 16
3.1.2. Anàlegs amb enllaços desfosfointernucleosídics 18
3.2. Modificacions en els sucres 19
3.2.1. Modificacions en 2’ 19
3.2.2. LNAs 19
3.2.3. Biciclo-DNAs 20
3.2.4. Hexoses 21
3.3. Oligòmers en els que se substitueix completament l’esquelet de
23
fosfat-ribosa
3.3.1. Àcids nucleics peptídics 23
3.3.2. Morfolino-oligonucleòtids 23
3.3.3. “Plastic”-DNAs 24
3.4. Modificacions en les nucleobases 24
3.4.1. Modificacions en pirimidines 24
3.4.2. Modificacions en purines 25
3.5. Conjugats en 5’ i 3’ 26
3.6. Generacions d’oligonucleòtids antisentit 27
3.6.1. Primera generació 27
3.6.2. Segona generació 27

4. Objectius 28

5. Bibliografia 28

CAPÍTOL 1. Oligonucleòtids cíclics 33

1. Introducció 35
1.1. Objectius 35
1.2. Dihidrofolat reductasa 36
1.3. Liposomes 38
1.3.1. Liposomes catiònics 39
1.3.2. Mecanisme 40

2. Oligonucleòtids cíclics 41
2.1 Descripció dels mètode de síntesi 41
2.2. Síntesi dels oligonucleòtids cíclics 43
2.2.1. Síntesi de la nucleotidil-resina 43
2.2.2. Elongació de la cadena oligonucleotídica 45
2.2.3. Ciclació, desancoratge i desprotecció 46
2.2.4. Anàlisi i purificació 49
1
2.2.5. Caracterització 50
2.2.6. Valoració de les síntesis 51
2.3. Síntesi de l’oligonucleòtid lineal fosforotioat (12PS) 52
2.3.1. Síntesi de l’oligonucleòtid 52
2.3.2. Anàlisi, purificació i caracterització 53

3. Assaig de l’activitat citotòxica dels oligonucleòtids cíclics 53

4. Oligonucleòtids cíclics fosforotioat 58
4.1. Propietats dels oligonucleòtids fosforotioat 58
4.2. Mètodes de síntesi 60
4.3. Síntesi de dímers cíclics fosforotioat 61
4.3.1. Estratègia convencional de síntesi 62
4.3.2. Assaig d’una nova estratègia per a la síntesi
67
d’oligonucleòtids cíclics completament fosforotioat
4.4. Discussió dels resultats 69

5. Bibliografia 69

CAPÍTOL 2. Abraçadores de guanina 75

1. Introducció i objectius 77
1.1. Anàlegs de citosina 78
1.2. Objectius 81

2. Disseny de la síntesi de les abraçadors de guanina 82

3. Síntesi dels monòmers de PNA 84
3.1. Intent de tenir una via comú per als dos monòmers 84
3.2. Obtenció dels monòmers de PNA de les abraçadores de guanina 86
3.2.1. Incorporació del 2-aminoresorcinol al 5-bromouracil 86
3.2.2. Ciclacions i reaccions de Mitsunobu 89
3.2.3. Incorporació de les nucleobases a l’esquelet
93
d’aminoetilglicina
3.3. Valoració de la síntesi dels monòmers de PNA 97

4. Bibliografia 100

CAPÍTOL 3. Síntesi de PNAs incorporant abraçadores de guanina i estudi de
103
l’estabilitat dels dúplexs PNA-DNA

1. Introducció 105
1.1. Origen del PNA 106
1.2. Característiques del PNA 107
1.2.1. Estabilitat química 107
1.2.2. Modes d’unió a DNA 107

2. Síntesi de PNA 109
2.1. Descripció del mètode de síntesi 109
2.1.1. Desprotecció 111
2.1.2. Acoblaments 112
2.1.3. Cicle de síntesi 113
2.1.4. Desancoratge i desprotecció final 114
2.2. Disseny i elecció de les seqüències 114
2.3. Síntesi de PNA a temperatura ambient 116
2
2.3.1. Síntesi dels oligòmers de PNA que contenen les
116
nucleobases naturals
2.3.2. Incorporació de les abraçadores de guanina en els
118
decàmers de PNA

2.4. Síntesi de PNA assistida per microones 120
2.4.1. Introducció a la utilització de microones en química
120
orgànica
2.4.2. Fonament teòric i aspectes pràctics 121
2.4.3. Estudi de l’acoblament de monòmers de PNA en un
124
microones convencional
2.4.4. Síntesi de PNA en un microones de cavitat monomodal 127

3. Estudi de l’estabilitat dels dúplexs PNA-DNA 132
3.1. Introducció 132
3.2. Estabilitat dels dúplexs formats pels PNAs que contenen
133
nucleobases naturals i DNA
3.3. Influència d’un “mismatch” en l’estabilitat del dúplex 136
3.4. Estabilitat dels dúplexs formats pels PNAs que contenen
139
abraçadores de guanina i DNA
3.5. Discussió dels resultats i nous experiments 142

4. Bibliografia 147

Conclusions 151

PART EXPERIMENTAL 157

Annex 213

3
4
Abreviatures
A: Adenina HOBt: 1-hidroxibenzotriazole
Ac O: anhídrid acètic HPA: àcid 3-hidroxipicolínic
2
ACN: acetonitril HPLC: cromatografia líquida d’elevada
AcOEt: acetat d’etil resolució
AcOH: àcid acètic iBu: isobutiril
AEG: aminoetilglicina Me: metil
anh: anhidre MeOH: alcohol metílic
ATT: 6-aza-2-tiotimina Mmt: monometòxitritil
Bhoc: benzhidriloxicarbonil MSNT: 1-mesitilensulfonil-3-nitro-1,2,4-
Boc: tert-butoxicarbonil triazole
tBuOOH: hidroperòxid de tert-butil NADP: nicotinamida adenina dinucleòtid
Bz: benzoil fosfat
C: citosina NMI: 1-metilimidazole
CA: citrat amònic NMP: N-metilpirrolidona
CCF: cromatografia de capa fina OD : densitat òptica a 260 nm
260
CHO: ovari de hàmster xinès OPC: cartutx de purificació d’oligo-
CNE: 2-cianoetil nucleòtids
DBU: 1,8-diazabicicle[5.4.0]-undec-7-è PAGE: electroforesi en gel de
DCC. N,N-diciclohexilcarbodiimida poliacrilamida
DCM: diclorometà PAL: àcid 5-(4-(9-fluorenilmetiloxi-
DEAD: dietilazodiarboxilat carbonil) aminoetil-3,5-dimetoxifenoxi)-
DHB: àcid 2,5-dihidroxibenzoic valèric
DHFR: dihidrofolat reductasa PEG-PS: polietilenglicol-poliestirè
DIEA: N,N-diisopropiletilamina Pf: punt de fusió
DIPAD: diisopropilazidicarboxilat Pip: piperidina
DIPCDI: N,N-diisopropilcarbodiimida PNA: àcid nucleic peptídic
DMF: N,N-dimetilformamida Pyr: piridina
DMI: 1,3-dimetilimidazolidinona Rdt: rendiment
DMSO: dimetilsulfòxid RMN: espectroscopia de resonància
DMT: 4,4’-dimetoxitritil magnètica nuclear
DNA: àcid desoribonuclèic RNA: àcid ribonuclèic
DOPE: 1,2-Dioleoil-sn-Glicero-3-fosfo- Stains all: bromur de 1-etil-2-{(E)-3-[1-
etanolamina etilnafto[1 2-d][1,3]tiazol-2(1H)-iliden]-
DOTAP: metilsulfat de N-[1-(2,3-Dioleoil- 2-metil-1-propenil}nafto[1,2-d][1,3]
oxi)propil]-N,N,N-trimetilamoni tiazol-1-i
DOTMA: clorur de (N-[1-(2,3- T: timina
dioleoiloxi)propil]-N,N,N-trimetilamoni) TBE: tampó Tris borat EDTA
dUMP: desoxiuridilat TCA: àcid tricloroacètic
EDC: hidroclorur de 1-(3-dimetilamino- TE: tampó tris-HCl; EDTA
propil)-3-etilcarbodiimida TEA: trietilamina
EDTA: àcid etilendiaminotetraacètic TEAAc: acetat de trimetilamoni
EM-ES: espectrometria de masses per TEAB: bicarbonat de trietilamoni
electrospray TEMED: N,N,N’,N’-tetrametiletilen-
EM-FAB: espectrometria de masses per diamina
bombardeig d’àtoms ràpids TFA: àcid trifluoroacètic
EM-IC: espectrometria de masses per TFMSA: àcid trifluorometansulfònic
ionització química THAP: 2,4,6-trihidroxiacetofenona
EM-IE: espectrometria de masses per THF: tetrahidrofurà
impacte electrònic T : temperatura de fusió
M
EM-MALDI-TOF: espectrometria de TMBS: trimetilbenzensulfònic
masses de desorció iònica provocada per TMG: 1,1,3,3-tetrametilguanidina
làser, assistida per matriu i anàlisi per TMP: timidilat
temps de vol UV-VIS: ultraviolat-visible
EtOH: alcohol etílic XAL: àcid 5-(9-aminoxanten-2-oxi)
Fmoc: 9-fluorenilmetoxicarbonil valèric
G: guanina Z: benziloxicarbonil
HATU: hexafluorofosfat 9-(7-azabenzo-
triazo-1-il)-1,1,3,3-tetraetiluroni
5

INTRODUCCIÓ I OBJECTIUS