123 ALP activity was present in cells in the three media, which - TDX

50 Pages·2012·4.23 MB·English

OSTEOGENESIS IN A SOFT HYDROGEL
ALP activity was present in cells in the three media, which implied that ALP was expressed also in 
control  medium,  as  previously  stated  for  COL1,  BSP  and  OC  (Figure  4.4.3‐6  A).  In  contrast, 
dexamethasone‐containing medium seemed to attenuate ALP activity, at least compared to the 
control  medium,  since  these  two  constructs  were  equally  contracted.  This  down‐regulation  is 
consistent with the fact that ALP is known to be strongly induced during matrix maturation stages, 
but declines during mineralization22,69, which only occurred in glucocorticoid‐treated constructs for 
the experiments here reported. In 2D cultures, osteogenic inhibition took place again in osteo+D 
medium, while ALP activity was clearly visualized in osteo medium (Figure 4.4.3‐6 B). Moreover, the 
same effect was evident on osteopontin (OPN) expression, determined by immunofluorescence 
(Figure 4.4.3‐6 B). Thus, this proves that the presence of dexamethasone in 2D cultures not only 
inhibits mineralization, as previously described, but the whole osteogenic process. 
Effect of contraction disruption on early osteogenesis 
Since the osteogenic process described was taking place in a contractile system and mesenchymal 
stem cells suffer a process of condensation during bone formation in vivo, it was interesting to 
determine  whether  osteogenesis  was  associated  to  construct  contraction.  For  this  reason,  the 
condensation process was disrupted either mechanically or chemically in different ways that are 
listed below: 
(1) By increasing the stiffness of the gel: Previously in this work, construct condensation was 
proven to be hindered as peptide concentration, and thus stiffness, increased (Figure 4.4.1‐
2). 
(2) By mechanically attaching the construct to the insert: When loading the mixture of peptide 
solution and cell suspension into an insert with dry membrane, the viscous liquid penetrated 
through the membrane, which caused the construct to remain attached after medium‐
inducted peptide self‐assembling. In fact, this effect was deliberately avoided in the rest of 
experiments by wetting the membrane with medium, prior to gel loading. 
(3) By effect of ROCK inhibitor: as previously described in this work, ROCK inhibitor decreased 
actin fiber contractility, which in turn obstructed global contraction (Figure 4.4.2‐4). 
In the first scenario (1), cells were encapsulated at three concentrations of self‐assembling peptide 
(0.15 %, 0.20 % and 0.25 % (w/v)) and osteocalcin (OC) expression was determined at the mRNA level 
at 4 and 8 days of culture in control medium. Under these conditions, MC3T3‐E1 cells did not show 
any significant change in OC expression depending on matrix stiffness (Figure 4.4.3‐7 A), although 
contraction degree was significantly different. Only the aforementioned gene up‐regulation with 
time was confirmed again. In independent experiments at 0.15 % and 0.30 % concentration, bone 
sialoprotein (BSP) was tested as well by qRTPCR at 8 days, but in this case constructs were not only 
cultured in control medium but also in osteo and osteo+D media (Figure 4.4.3‐7 B). Again, the up‐
regulation in distinct stiffness was at the same level in all media, proving that the same result was 
obtained in control and under osteogenic inducers. Therefore, although just a 3‐fold difference in 
123
CHAPTER 4

stiffness was able to dramatically promote morphological changes, it did not significantly affect 
osteogenesis, at least up to 8 days. 
Consistent with OC and BSP findings, alkaline phosphatase activity was also present on cells cultured 
for 12 days in gels at three peptide concentrations (0.15 %, 0.20 % and 0.25 %), as observed in Figure 
4.4.3‐7 C. In these pictures the difference in contraction, even after 12 days of culture, was evident, 
as well as the lack of cellular network at 0.25 % concentration at higher magnification. At this higher 
concentration some few cells remain within the hydrogel, but most of them just form big cellular 
agglomerates on the surface of the hydrogel. This is the main reason why experiments were initially 
designed at very low hydrogel stiffness and the system was not further characterized at higher 
concentrations, as most of the cells were no longer embedded in the hydrogel. 

Figure 4.4.3‐7. Osteogenic markers expression at different matrix stiffness. (A) OC was analyzed by qRTPCR 
on constructs at 0.15 %, 0.20 % and 0.25 % peptide concentration and cultured in control medium at 4 and 8 
days. (B) BSP was analyzed by qRTPCR on 0.15 % and 0.30 % constructs after 8 days of culture in control, 
osteo and osteo+D media. Statistics report not significant (ns) differences. (C) ALP activity was assessed by 
BCIP/NBT staining in three constructs (0.15 %, 0.20 % and 0.25 % peptide concentration) in control media 
(12 days). Bar represents 1 mm for pictures in the first raw and 100 m for the second raw. 
In  a  second  attempt  to  stop  contraction  (2),  some  constructs  at  0.15 %  and  0.30 %  peptide 
concentration were attached to the membrane of the insert. The typical contracting gel at 0.15 % 
concentration was unable to shrink when attached to the membrane (Figure 4.4.3‐8 A, first row), 
which  proved  that  the  gel  was  indeed  physically  attached  and  that  this  condition  impeded 
contraction. Anyhow, cells were observed to elongate and pull, creating some kind of holes in the 
structure, since cells were unable to detach the gel. At 0.30 % concentration (Figure 4.4.3‐8 A, second 
124
OSTEOGENESIS IN A SOFT HYDROGEL
row), neither the floating construct nor the attached one could contract, as expected since the matrix 
is stiff enough to resist cell traction force. Anyway, in stiffer constructs, cells seemed to elongate 
more in attached cultures than in floating ones (not shown) and actually those holes described in the 
hydrogel –probably due to cells dragging the matrix‐ were also detected. Indeed, cells in attached 
hydrogels are in a very different mechanical environment, compared to free‐floating gels, due to the 
extra mechanical tension produced by matrix attachment. This effect was widely studied in collagen 
gels by Grinnell’s group regarding wound healing70,71 and by Keely’s group in breast cancer72,73, and it 
is not the scope of this work to focus on this issue in detail. Nevertheless, OC show not significant 
difference in expression in floating and attached constructs at both matrix stiffness values tested 
(Figure 4.4.3‐8 B). 

Figure 4.4.3‐8. Osteocalcin expression in disrupted contraction by construct attachment to the membrane. (A) Size 
and morphology of floating and attached constructs at 0.15 % and 0.30 % peptide concentration after 4‐day culture 
in control medium. (B) Comparison of OC expression in attached and floating gels at 0.15 % and 0.30 % peptide 
concentration, cultured for 4 days in control medium. Statistics reported non‐significant (ns) differences. 
In another set of experiments (3), contraction was disrupted by the addition of the ROCK inhibitor 
Y‐27632 at 1 and 10 μM. Again, after 4‐day culture qRTPCR analysis revealed that the reduction in 
cell contractility did not involve a variation of the osteocalcin expression (Figure 4.4.3‐9). Hence, in 
the 3D system studied, the osteogenic process, both spontaneous and induced, did not show any 
direct relation to construct contraction and biomechanics –at least at early stages of osteogenesis. 
Therefore, once in this soft 3D environment, calvaria MC3T3‐E1 cells seemed to engage into a default 
pathway of osteogenesis, regardless of cell contractility and network formation. Thus, contraction 
forces and osteogenesis seemed to be uncoupled in this model. This conclusion would be, in fact, in 
accordance with the expected intramembranous model of bone formation ‐as it happens in skull 
bones like calvaria‐, which is not subjected to mechanical loading during development. However, the 
stiffness values used in this work (100‐300 Pa) are too low to expect a mechanical induction of 
osteogenesis,  since  other  reports  described  enhanced  bone  formation  at  much  higher  matrix 
stiffness values (around 30 and 60 kPa)48,49. However, it is not dismissed that the contraction could be 
mechanically  stimulating  bone  formation  at  long‐term,  since  construct  stiffness  was  noticeably 
increased with time (values have not been determined yet). In agreement with this system, others 
125
CHAPTER 4

have shown that pre‐osteogenic cells in compliant matrices with contractile behavior displayed 
greater osteogenic maturation than in stiffer non‐contractile scaffolds74. 

Figure 4.4.3‐9. Osteocalcin expression in disrupted contraction by addition of cell 
contractility inhibitor. OC was analyzed by qRTPCR in constructs (0.15 % peptide) 
cultured for 4 days in the presence of 1 and 10 M ROCK inhibitor Y‐26732, 
compared to control medium. Statistics reported non‐significant (ns) differences. 
Intramembranous ossification mechanism: no cartilage‐related markers 
Besides bone‐related genes, the expression of some chondrogenic markers was also checked, since 
previous experiments with mouse embryonic fibroblasts (MEFs) in RAD16‐I hydrogel showed a 
default cell commitment to chondrogenesis59. Therefore, the production of collagen type II and 
glycosaminoglycans (GAGs), major components of cartilage matrix, was evaluated in MC3T3‐E1 
constructs. As expected, collagen type II alpha 1 (Col2a1) expression was never detected by qRTPCR, 
neither were glycosaminoglycans by toluidine blue staining (Figure 4.4.3‐10). These results ruled out 
the possibility of a cartilage‐like intermediate, in agreement with an intramembranous osteogenic 
pathway, as it happens during calvaria bone development. 

Figure  4.4.3‐10.  Glycosaminoglycans  staining  on 
MC3T3‐E1  construct.  Toluidine  blue  staining  on  a 
construct at 0.15 % after 20 days in control medium. 
4.4.4. CELL VIABILITY IN THE CONSTRUCTS
One  major  issue  when  dealing  with  tissue  engineering  products  is  to  ensure  cellular  viability. 
Therefore, viability of MC3T3‐E1 cells within the self‐assembling peptide and along the contraction 
process was assessed. Firstly, viability was analyzed on a construct cultured in control medium for a 
126
OSTEOGENESIS IN A SOFT HYDROGEL
long period of time (42 days). Figure 4.4.4‐1 shows its 3D reconstruction from different optical 
sections, where most of the cells stained green ‐alive‐ and only few nuclei stained red –dead. Hence, 
cells –both on the surface and within the matrix‐ remained mostly viable after encapsulation, 
construct condensation and prolonged culture. 

Figure 4.4.4‐1. 3D image of cellular viability of a MC3T3‐E1 construct. 
The image is a 3D reconstruction from optical sections taken with 
Zeiss ApoTome system. The construct (40 l) was cultured in control 
medium for 42 days (0.15 % gel). 
Moreover, viability was also assessed at other working conditions: in constructs at two different 
matrix stiffness (100 and 440 Pa, corresponding to 0.15 % and 0.30 % peptide concentration) and 
after culture in the three tested media: control, osteo and osteo+D. Regarding stiffness, higher 
material stiffness and consequent restriction of contraction did not seem to increase cellular death 
(see Figure 4.4.4‐2, first row). In both cases, only few cells stained red after 19 days of culture in 
control medium. Nevertheless, again clear morphological differences were stated. On one hand, cells 
in 0.15 % hydrogels easily created a continuous network throughout the whole construct. On the 
other hand, in 0.30 % gels, only cells at the perimeter were able to interact and form network while 
cells in the center remained as clusters. 
Cells cultured in osteo medium showed similar viability to cells in control medium. Hardly any dead 
cells  were  observed  at  both  peptide  concentrations,  but  the  stiff  hydrogel  promoted  cellular 
aggreates (Figure 4.4.4‐2, second row). Conversely, more dead cells were detected in both peptide 
concentrations in the presence of dexamethasone (Figure 4.4.4‐2, third row). In addition, cells in 
0.15 % gels were organized differently, since they changed the homogeneous network observed in 
control and osteo media for cellular aggregations that created pores around 100 m, which seemed 
to more closely resemble bone structure. An increase in cell death in differentiating conditions is not 
surprising, since it is actually in agreement with the natural cell death occurring after cellular 
specialization  and  maturation  in  vivo75.  Moreover,  apoptosis  (programmed  cell  death)  has  an 
important role in development and morphogenesis and contributes substantially to bone turnover 
and regeneration76. 
127
CHAPTER 4

Figure 4.4.4‐2. Cellular viability at different matrix stiffness and media. Individual optical sections (10X objective) of 
constructs stained for viability (live cells stain green and dead cells, red) in 0.15 % and 0.30 % gels. Cells were cultured for 
19 days in three different media: control, osteo, and osteo+D. In 0.30 % gels, two images are shown: one from cells in the 
periphery and the other from the cells in the center of the construct. White bars correspond to 200 m. 
4.4.5. MC3T3‐E1 CONSTRUCTS UNDER THE INFLUENCE OF OTHER MEDIUM SUPPLEMENTS
As mentioned earlier, mouse embryonic fibroblasts (MEFs) also undergo a contraction process similar 
to MC3T3E1 cells, once embedded in self‐assembling peptide hydrogel59. In this 3D environment, 
MEFs constructs reached a bilateral closed structure, in most of the cases. Besides the cell type, both 
experiments differ in the formulation of the culture medium, since MEFs were cultured in 15 % 
serum  supplemented  in  some  cases  with  20 nM  PDGF  (platelet‐derived  growth  factor‐BB)  to 
normalize the variations in serum quality and origin. Precisely, due to the deviations observed with 
serum, all the experiments with MC3T3‐E1 cells were always conducted with the same fetal bovine 
serum (same batch) heat inactivated from South American origin. In that work with MEFs, those cells 
were reported to suffer dedifferentiation into a multipotent mesenchymal progenitor and a default 
commitment to chondrogenesis. 
Therefore, following this previous work in the group, it was decided to test osteoprogenitor behavior 
under the influence of the same supplements as in MEFs cultures. Consequently, MC3T3‐E1 cells 
were encapsulated in 0.15 % RAD16‐I peptide and cultured at 10 % and 15 % FBS, with or without 
PDGF. 
128
OSTEOGENESIS IN A SOFT HYDROGEL
Effect of serum concentration and PDGF on the contraction pattern 
Indeed, when cultured in 15 % FBS and 20 nM PDGF, MC3T3‐E1 cells modified their contraction 
pattern and achieved a final closed bilateral morphology, as MEFs did (Figure 4.4.5‐1). Sometimes, 
this shape could be also observed in 10 % FBS and PDGF, but not in all cases. In the absence of PDGF, 
the typical round structure with the perimetric prominence was always obtained, regardless of the 
serum concentration. However, under the combination of 15 % FBS and PDGF, the contraction 
process seemed to occur in general faster than in 10 % FBS. These observations indicate that 
additional supplements change the contraction pattern to which MC3T3‐E1 cells are subjected. PDGF 
is actually involved in many signaling pathways. It has been reported to stimulate migration and 
proliferation in many cells and in MC3T3‐E1 cell line77, in particular. In 3D cultures of human 
fibroblasts ‐encapsulated in collagen type I gels‐, PDGF was reported to have a promigratory effect, 
while serum had a procontractile effect78. Hence, it is not surprising that PDGF and serum ‐containing 
many other growth factors‐ have a critical role in construct morphogenesis. 

Figure  4.4.5‐1.  Final  construct  morphology  depending  on  FBS 
concentration and PDGF addition. MC3T3‐E1 cells in 0.15 % peptide 
were cultured in 10 % and 15 % FBS in the presence or absence of 
PDGF. Final morphology is depicted after 20 days of culture.  
Evaluation of a cartilage intermediate in MC3T3‐E1 cultures in new medium conditions 
The hypothesis to explain spontaneous chondrogenesis in MEFs cultures was that lower oxygen 
concentration might exist in the inner of the closed construct. New results in the group show that 
chondrogenesis do not longer take place in smaller constructs (40 and 20 l, compared to the regular 
80 l), where oxygen diffusion might not be an issue any more79. Consequently, it was decided to 
repeat  glycosaminoglycans  staining  on  MC3T3‐E1  to  rule  out  the  possibility  that  chondrogenic 
differentiation could be taking place in the inner part of the construct. Figure 4.4.5‐2 A depicts 
negative glycosaminoglycan staining for MC3T3‐E1 at any media, even in the closed structures, 
where low oxygen concentrations might be possible. At the right (Figure 4.4.5‐2 B), positive staining 
for MEFs is shown in the paraxial areas. Dissection was always performed to ensure typical blue‐
purple stain of the matrix, since it might not be evident on the whole construct. Therefore, in spite of 
imitating  the  environment  for  spontaneous  chondrogenic  commitment  in  MEFs,  MC3T3‐E1 
constructs did never show any sign of a cartilage intermediate, indicating that these cells do not 
change their osteogenic commitment. 
129
CHAPTER 4

Figure  4.4.5‐2.  Glycosaminoglycans  staining  on  MC3T3‐E1  constructs  depending  on  the  media 
supplements. Toluidine blue staining on (A) MC3T3‐E1 constructs after 20 days in different media (10 % 
and 15 % FBS, ‐/+ PDGF) and (B) MEFs construct after 15 days culture in 15 % FBS and 20 nM PDGF. 
Evaluation of spontaneous osteogenic markers expression in 15 % serum and PDGF 
Some analyses were performed on MC3T3‐E1 encapsulations cultured in 15 % FBS and PDGF to 
determine if the new medium was changing the expression profile of the constructs. On the contrary, 
spontaneous expression of bone‐related markers was taking place without the addition of osteogenic 
inducers (ascorbic acid, ‐glycerophosphate and dexamethasone), as it happened in control medium 
(10 % FBS). Figure 4.4.5‐3 A shows that osteocalcin expression was up‐regulated at 4 days of culture, 
even to a greater extent than in control medium, although changes were not significant. Moreover, 
alkaline phosphatase staining and osteopontin immunofluorescence for 16‐days constructs were 
positive. On the other hand, von Kossa staining for mineralization was negative for the same samples 
(Figure  4.4.5‐3  B).  These  results  suggest  that  no  important  differences  in  terms  of  osteogenic 
differentiation took place due to the increase of serum concentration and the addition of PDGF, at 
least in the absence of osteogenic inducers. 

Figure 4.4.5‐3. Expression of osteogenic markers in MC3T3E1 constructs cultured in 15 % FBS and PDGF. (A) Alkaline 
phosphatase staining, von Kossa staining and osteopontin immunofluorescence (primary and secondary antibody, 
on the left, and control with only secondary antibody, on the right). Stainings were performed in construct slices. (B) 
Osteocalcin expression analyzed by qRTPCR in 4‐day constructs cultured in 10 % FBS and 15 % FBS plus PDGF. 
130
OSTEOGENESIS IN A SOFT HYDROGEL
The differentiation of those 3D cultures in osteogenic media (osteo and osteo+D) was also assessed 
in parallel experiments to the ones conducted in 10 % FBS, as described in the previous sections. The 
control medium was formulated with 15 % FBS and 20 nM PDGF, but no modification was made in 
osteogenic media (formulated in 10 % FBS and no PDGF). Therefore, the only difference for the 
osteogenic cultures was that the first 4 days they were cultured in the new medium. Hence, very 
similar results were expected compared to the previous ones, since serum and PDGF did not seem to 
affect spontaneous osteogenesis. 
Surprisingly, at 24 days of culture, no mineralization was observed in the presence of dexamethasone 
(Figure 4.4.5‐4 A), contrary to the previous experiments, where a fully mineralized matrix was always 
obtained at that time. The only sign of positive von Kossa staining was in osteo medium, where the 
compact cell layer on the surface started mineralizing in a 2D fashion (shown in further detail in 
Figure 4.4.5‐4 B). Repetitions of the same experiment reported the same results. Interestingly, a 
short treatment of the constructs with PDGF and 15 % FBS dramatically altered the mineralization 
pattern. Studies report that treatment with PDGF showed inhibited mineralization in cultures of 
mesenchymal  stem  cells80,  pre‐osteogenic  MC3T3‐E1  cells  and  pre‐osteocytic  MLO‐A5  cells81. 
Nonetheless, for a long time PDGF was known to be involved in bone formation and a recent report 
by Caplan et al. ascribes a crucial role in bone healing to PDGF82. That work highlights PDGF functions 
in  the  recruitment  of  osteoprogenitor  cells  at  a  specific  site,  the  induction  of  their  efficient 
multiplication, the modulation of their responsiveness to osteoblastic differentiation factors and the 
stabilization of newly formed blood vessels. Therefore, the addition of PDGF into the medium 
renders a very complex scenario that would require more research to elucidate the present results. 
However, the system here presented seems to be capable to respond to PDGF stimuli and to 
mineralize in condition that might be more biomimetic, since dexamethasone is not required.  

Figure 4.4.5‐4. Effect of pre‐culture in 15 % FBS and PDGF on mineralization. MC3T3‐E1 constructs were cultured 
for 4 days in medium containing 15 % FBS and PDGF and then changed to osteo and osteo+D. (A) von Kossa 
staining at 16 and 24 days. (B) Detail of the mineralized area of the construct in osteo medium at 24 days. 
131
CHAPTER 4

4.5. CONCLUDING REMARKS
During  embryonic  development  of  bone,  condensation  of  progenitor  cells  is  considered  a 
fundamental step, both in intramembranous and endochondral mechanisms, because it promotes 
increased cellular contacts and cell‐to‐cell communication, which are critical in tissue formation19. At 
the moment, many osteogenic models in hydrogels, such as the commonly used PEG and alginates, 
usually constrain cells within the matrix impeding the aforementioned cellular connections48‐50,53. 
Hence, as an alternative, we devised a three‐dimensional osteogenic model, which could somehow 
recapitulate the first steps of bone formation. To this purpose, a soft nanofiber hydrogel made of 
self‐assembling  peptides  was  used  as  scaffold  material.  Under  the  appropriate  biomechanical 
conditions ‐that is at initial matrix stiffness around 100 Pa‐, MC3T3‐E1 cells are able to elongate, 
migrate and interact to each other creating a rich interconnected cell‐cell network within the first 
days of culture. 
The  cellular  contractile  forces  induce  the  condensation  of  the  cells  and  extracellular  matrix 
components, thereby increasing the local concentration of signaling molecules. Moreover, hydrogel 
also suffers a spontaneous contraction, suggesting that the intrinsic capacity of the biomaterial to 
contract may also contribute to the process here described. This progression may be interesting for 
tissue engineering, since the system spontaneously evolves from a soft fragile hydrogel to a dense 
cohesive  structure.  This  process  is  possible  by  the  effect  of  a  cellular  network  undergoing 
condensation.  When  cells  were  encapsulated  into  slightly  stiffer  gels,  cells  typically  formed 
aggregates and the contraction was inhibited, which finally rendered less stiff and non‐homogeneous 
constructs. For this reason, compliant unrestrictive and contractile hydrogels might certainly be good 
candidates to generate tissue‐like constructs.  
Interestingly, osteoprogenitor cells within this self‐assembling peptide gel have been shown to 
spontaneously up‐regulate the expression of bone‐related genes in the absence of any osteogenic 
inducer. Moreover, those up‐regulations reached the expression levels in constructs cultured in 
osteogenic medium (with ascorbic acid and beta‐glycerophosphate). Therefore, the 3D system may 
be osteoinductive by itself, due to the increased cell‐cell contacts in a 3D configuration, the rise in 
stiffness over time or both. At the moment of writing this thesis, the stiffness values were not 
quantified yet, since it is rather complex due to the non‐defined geometry and the small size of the 
constructs. Besides the osteoinductive capacity of the system, a more potent inducer such as 
dexamethasone was required to acquire a final osteogenic phenotype, typically characterized by 
matrix mineralization. Glucocorticoid‐induced osteogenesis is widely used in many protocols, but it 
alters collagen type I and osteocalcin expression. Hence, for a more biomimetic bone formation, it 
would  be  interesting  to  try  replacing  dexamethasone  with  other  osteogenic  inducer  (i.e. 
1,25‐dihydroxyvitamin D3). The response to inductive factors evidenced the different behavior of 
MC3T3‐E1 cells in 2D and 3D systems, since cells in self‐assembling peptide seem to lose certain 
132