Thesis – Ari Setyan

220 Pages·2009·6.28 MB·English

Institut universitaire romand de Santé au Travail

Assessment of particulate exposure and surface
characteristics in association with urinary levels
of 8-hydroxy-2’-deoxyguanosine, considered
as marker of oxidative stress

Thèse de doctorat ès sciences de la vie (PhD)

présentée à la Faculté de Biologie et de Médecine de
l’Université de Lausanne

par

Ari SETYAN

Chimiste diplômé de l’Université de Genève, Suisse

Jury

Prof. Valentin Rousson, Président
Prof. Michel Guillemin, Directeur de thèse
Dr Michel J. Rossi, co-Directeur de thèse
Dr Thomas Kuhlbusch, Expert
Dr Jean-Jacques Sauvain, Expert
Dr Michael Riediker, Expert

Lausanne, 2009

Abstract 3
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Abstract

Epidemiological studies have demonstrated that exposure to fine particles is associated to
adverse health effects, including cancer, respiratory and cardiovascular diseases. However,
mechanisms by which particles induce health effects remain unclear. According to one of the
most investigated hypotheses, particles cause adverse effects through the production of
reactive oxygen species (ROS), which are very hazardous compounds able to attack directly
biological structures, including the DNA strand or the lipid bilayer of the cells. If the defense
mechanisms, constituted of antioxidants, are not able to counter ROS, then these compounds
will cause in the body a range of oxidation reactions called “oxidative stress”.

The aim of the present research project was to better understand mechanisms by which
exposure to fine particles induces oxidative stress. The first point of this project was to check
whether exposure to high levels of fine particles is directly linked to oxidative stress, and
whether this oxidative stress is accompanied by the activation of the defense mechanisms
(antioxidants). The second point was to study the role played by the particle surface
characteristics in the oxidative stress process.

For that purpose, a study was conducted in bus depots with the participation of 40 mechanics.
First, occupational exposure to particles (PM ) and to other pollutants (NO , O ) was
4 x 3
measured over a two-day period. Then, urine samples of mechanics were collected in order to
measure levels of 8-hydroxy-2’-deoxyguanosine (8OHdG) and antioxidants. 8OHdG is a
molecule formed by the oxidation of DNA and allowing to assess the oxidative stress status of
the mechanics. Finally, particles were collected on filters, and functional groups located on
the particle surface were analyzed in the laboratory using a Knudsen flow reactor. This
technique allows not only to quantify functional groups on the particle surface, but also to
measure the reaction kinetics.

Results obtained during the field campaign in bus depots showed that mechanics were
exposed to rather low levels of PM (20-85 μg/m3) and of pollutants (NO : 100-1000 ppb; O :
4 x 3
<15 ppb). However, despite this low exposure, urinary levels of the oxidative stress biomarker
(8OHdG) increased significantly for non-smoking workers over a two-day period of shift.
4 Abstract
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This oxidative stress was accompanied by an increase of antioxidants, indicating the
activation of defense mechanisms. On the other hand, the analysis of functional groups on the
particle surface showed important differences, depending on the workplace, the date and the
activities of workers. The particle surface contained simultaneously antagonistic functional
groups which did not undergo internal reactions (such as acids and bases), and was usually
characterized by a high density of carbonyl functions and a low density of acidic sites.
Reaction kinetics measured using the Knudsen flow reactor pointed out fast reactions of
oxidizable groups and slow reactions of acidic sites. Several exposure parameters were
significantly correlated with the increase of the oxidative stress status: the presence of acidic
sites, carbonyl functions and oxidizable groups on the particle surface; reaction kinetics of
functional groups on the particle surface; particulate iron and copper concentrations; and NO
x
concentration.
Résumé 5
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Résumé

Des études épidémiologiques ont démontré qu’une exposition aux particules fines provoque
des effets néfastes sur la santé, tels que cancer, maladies respiratoires et cardio-vasculaires.
En revanche, de nombreuses zones d’ombre demeurent sur les mécanismes par lesquels ces
particules agissent sur la santé. Selon l’une des hypothèses les plus étudiées actuellement, les
particules agiraient par l’intermédiaire d’espèces oxygénées réactives, composés très
dangereux capables d’attaquer directement des structures biologiques comme l’ADN ou les
lipides membranaires. Si les mécanismes de défense, constitués d’antioxydants, ne sont pas
capables de contrer les espèces oxygénées réactives, ces dernières provoquent dans
l’organisme une série de réactions d’oxydation regroupées sous le terme « stress oxydatif ».

Le présent projet de recherche vise à mieux comprendre les mécanismes par lesquels une
exposition aux particules fines aboutit à un stress oxydatif. Le premier but du projet est de
vérifier si une exposition régulière à des niveaux élevés de particules fines est directement liée
au stress oxydatif, et si ce stress oxydatif est accompagné par une activation des systèmes de
défense (antioxydants). Le deuxième but est d’étudier plus précisément le rôle joué par les
propriétés de la surface des particules dans le processus de stress oxydatif.

Pour répondre à ces questions, une étude à été menée dans des dépôts de bus avec la
participation de 40 mécaniciens. Dans un premier temps, le niveau d’exposition des
mécaniciens aux particules (PM ) et à d’autres polluants (NO , O ) a été mesuré sur une
4 x 3
période de deux jours. Ensuite, des échantillons d’urines ont été collectés auprès des
mécaniciens pour mesurer les concentrations en 8-hydroxy-2’-deoxyguanosine (8OHdG) et en
antioxydants. La 8OHdG est une molécule provenant de l’oxydation de l’ADN et permettant
d’évaluer le niveau de stress oxydatif des travailleurs. Finalement, des particules ont été
échantillonnées sur filtres, et les groupes chimiques à la surface de ces particules ont ensuite
été analysés en laboratoire avec un réacteur à écoulement de Knudsen. Cette technique permet
non seulement de quantifier le nombre de groupes chimiques à la surface des particules, mais
aussi d’étudier leur cinétique de réaction.
6 Résumé
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Les résultats obtenus lors de la campagne d’échantillonnage sur le terrain ont montré que les
ouvriers des dépôts de bus étaient exposés à des concentrations relativement faibles de PM
4
(20-85 μg/m3) et de différents polluants (NO : 100-1000 ppb; O : <15 ppb). Cependant,
x 3
malgré ces faibles niveaux d’exposition, le biomarqueur de stress oxydatif (8OHdG) a
augmenté de façon significative dans l’urine des mécaniciens non-fumeurs durant deux jours
consécutifs de travail dans les dépôts de bus. Ce stress oxydatif était accompagné d’une
augmentation des antioxydants, indiquant l’activation des systèmes de défense. Parallèlement,
l’analyse des groupes chimiques à la surface des particules ambiantes dans les dépôts de bus a
montré de très grandes différences en fonction du lieu, de la date et des activités des ouvriers.
La surface des particules ambiantes contenait plusieurs fonctions antagonistes qui coexistaient
sans subir de réactions internes (telles que des acides et des bases), et était généralement
caractérisée par une densité élevée de fonctions carbonyls, et une faible densité de sites
acides. La cinétique de réaction mesurée avec le réacteur de Knudsen a indiqué une vitesse de
réaction rapide pour les groupes chimiques oxydables, ainsi qu’une vitesse de réaction lente
pour les sites acides. Plusieurs paramètres d’exposition ont montré une corrélation
significative avec l’augmentation du stress oxydatif : la présence d’acides, de carbonyls et de
fonctions oxydables à la surface des particules; la cinétique de réaction des groupes chimiques
à la surface des particules; les concentrations en fer et en cuivre particulaires; et la
concentration en NO .
x
Table of contents 7
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Table of contents

Abstract………………………………………………………………………………….. 3
Résumé…………………………………………………………………………………... 5
Table of contents………………………………………………………………………... 7
List of figures……………………………………………………………………………. 11
List of tables…………………………………………………………………………….. 15
Abbreviations…………………………………………………………………………… 19
1. Introduction…………………………………………………………………………. 21
1.1 The air………………………………………………………………………. 21
1.2 Particulate matter…………………………………………………………… 21
1.3 Oxidative stress……………………………………………………………... 26
1.4 Oxidative stress biomarkers………………………………………………… 28
1.5 Aim of the research project…………………………………………………. 30
1.6 Institute for Work and Health………………………………………………. 31
1.7 Swiss Federal Institute of Technology (Air and Soil Pollution Laboratory).. 32
1.8 Outline of the thesis………………………………………………………… 32
1.9 References…………………………………………………………………... 33
2. Design of the field campaign……………………………………………………….. 41
2.1 Ethics Committee…………………………………………………………… 41
2.2 Sampling sites………………………………………………………………. 41
2.3 Population under study……………………………………………………… 47
2.4 Biological fluids sampling………………………………………………….. 50
2.5 Measurements and analysis…………………………………………………. 50
2.6 Reference…………………………………………………………………… 51
3. Exposure parameters……………………………………………………………….. 53
3.1 Introduction…………………………………………………………………. 53
3.2 Material and methods……………………………………………………….. 56
3.2.1 Stationary sampling……………………………………………….. 56
3.2.2 Personal sampling………………………………………………… 60
3.2.3 Statistical analyses………………………………………………... 61
3.3 Results and discussion……………………………………………………… 61
8 Table of contents
___________________________________________________________________________
3.3.1 Stationary sampling……………………………………………….. 61
3.3.2 Personal sampling………………………………………………… 80
3.3.3 Comparison between stationary and personal samplings………… 83
3.3.4 Summary…………………………………………………………... 84
3.4 Conclusion………………………………………………………………….. 84
3.5 References…………………………………………………………………... 85
4. Particle surface characterization…………………………………………………... 89
4.1 Introduction…………………………………………………………………. 89
4.2 Material and methods……………………………………………………….. 91
4.2.1 Knudsen flow reactor……………………………………………... 91
4.2.2 Probe gases……………………………………………………….. 95
4.2.3 Samples……………………………………………………………. 98
4.2.4 Particle mass……………………………………………………… 104
4.2.5 Particle size distribution………………………………………….. 104
4.2.6 Kinetics of heterogeneous titration reactions…………………….. 106
4.2.7 Statistical analyses………………………………………………... 107
4.3 Results and discussion……………………………………………………… 107
4.3.1 Laboratory-generated aerosols…………………………………… 109
4.3.2 Carbonaceous particles…………………………………………… 112
4.3.3 TiO particles……………………………………………………... 118
2
4.3.4 Aerosols collected in the field…………………………………….. 121
4.3.5 Kinetics of heterogeneous titration reactions…………………….. 128
4.4 Conclusion………………………………………………………………….. 131
4.5 References…………………………………………………………………... 132
5. Markers of biological effects……………………………………………………….. 141
5.1 Introduction…………………………………………………………………. 141
5.2 Material and methods……………………………………………………….. 147
5.2.1 Chemicals…………………………………………………………. 147
5.2.2 Analytical method of urinary 8OHdG by HPLC-ECD……………. 148
5.2.3 Analytical method of urinary 8OHdG by LC-MS/MS…………….. 150
5.2.4 Measurement of urinary creatinine……………………………….. 151
5.2.5 Measurement of urinary antioxidants…………………………….. 153
5.2.6 Statistical analyses………………………………………………... 153
5.3 Results and discussion……………………………………………………… 153
Table of contents 9
___________________________________________________________________________
5.3.1 Analytical method of urinary 8OHdG by HPLC………………….. 153
5.3.2 Analytical method of urinary 8OHdG by LC/MS-MS…………….. 160
5.3.3 Summary of the analytical methods………………………………. 165
5.3.4 Levels of urinary 8OHdG for workers in bus depots……………... 166
5.3.5 Levels of urinary antioxidants for workers in bus depots………… 171
5.4 Conclusion………………………………………………………………….. 175
5.5 References…………………………………………………………………... 176
6. Correlations between oxidative stress and exposure parameters………………... 183
6.1 Introduction…………………………………………………………………. 183
6.2 Material and methods……………………………………………………….. 184
6.3 Results and discussion……………………………………………………… 186
6.3.1 Correlations between exposure parameters………………………. 186
6.3.2 Correlations between 8OHdG and personal data, lifestyle factors
and exposure parameters………………………………………… 188
6.3.3 Normality test……………………………………………………... 191
6.3.4 Statistical models………………………………………………….. 193
6.4 Conclusion………………………………………………………………….. 195
6.5 References…………………………………………………………………... 196
7. Conclusion and perspectives……………………………………………………….. 201
8. Annexes……………………………………………………………………………… 203
8.1 Questionnaire……………………………………………………………….. 203
8.2 Stationary sampling………………………………………………………… 205
8.3 Personal sampling…………………………………………………………... 207
8.4 Uptake measurements on aerosols collected in the workplaces using the
Knudsen flow reactor………………………………………………………. 208
8.5 Urinary concentrations of 8-hydroxy-2’-deoxyguanosine………………….. 209
8.6 Urinary concentrations of creatinine………………………………………... 210
8.7 Urinary concentrations of antioxidants……………………………………... 211
Remerciements………………………………………………………………………….. 213
Curriculum Vitae……………………………………………………………………….. 215
List of publications……………………………………………………………………… 217