terapia celular y génica con timulina e igf-1 en modelos animales de neuroinflamación

198 Pages·2017·7.28 MB·Spanish

Tesis para optar al grado de Doctor en Ciencias Médicas

TERAPIA CELULAR Y GÉNICA CON TIMULINA E IGF-1
EN MODELOS ANIMALES DE NEUROINFLAMACIÓN

AUTORA: LIC. MARÍA FLORENCIA ZAPPA VILLAR

DIRECTORA: Dra. Paula C. Reggiani
CO-DIRECTORES: Dr. Rodolfo G. Goya y Dr. Gustavo R. Morel

Instituto De Investigaciones Bioquímicas De La Plata
`Profesor Doctor Rodolfo R. Brenner´
Facultad De Ciencias Médicas - Universidad Nacional De La Plata

2018
RECONOCIMIENTOS

Al Instituto de Investigaciones Bioquímicas de La Plata (INIBIOLP) de la Facultad de Ciencias Médicas
(FCM), Universidad Nacional de La Plata (UNLP), por haberme brindado el espacio y los medios para
la ejecución de esta Tesis.

A las Instituciones que han financiado mi trabajo de investigación:
- Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET)
- Universidad Nacional de La Plata (UNLP)
- Ministerio de Ciencia y Técnica (MinCyT)
- Agencia Nacional de Promoción Científica y Tecnológica (ANPyT)
- Organización Internacional de Investigación del Cerebro (IBRO)
- Fundación de Apoyo a la Investigación de Río de Janeiro (FAPERJ)
- Centro Argentino-Brasileño de Biotecnología (CABBIO)

A la Dra. Gloria M. Cónsole y a los integrantes de la Cátedra de Histología y Embriología B, FCM-UNLP.
A los miembros de la Cátedra de Patología B, FCM-UNLP.

Al Dr. Sergio T. Ferreira y a todos los integrantes del Laboratório de Doenças Neurodegenerativas,
Instituto de Bioquímica Médica Leopoldo de Meis, Universidad Federal de Río de Janeiro, Brasil.

A la Dra. Mariana G. García del Laboratorio de Terapia Génica, Instituto de Investigaciones en
Medicina Traslacional (IIMT), Facultad de Ciencias Biomédicas, Universidad Austral, Buenos Aires.

A los mentores de la Escuela de Neurociencias de la Universidad McGill, Canadá: Dr. Albert J. Aguayo,
Dr. Ante L. Padjen, Dra. Melissa Vollrath, Dr. David Ragsdale y Dr. Ellis Cooper

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AGRADECIMIENTOS

Sin lugar a dudas, el desarrollo de la presente Tesis Doctoral constituye un logro compartido con
muchas personas que han contribuido con este trabajo a lo largo de estos años. Es a ellas a quienes
dirijo este pequeño apartado.

En primer lugar, a mi directora, Dra. Paula C. Reggiani, por su gran confianza y compromiso para
conmigo. Por enseñarme todo sin verticalidades y alentarme a crecer, apoyando mis debilidades y
potenciando mis virtudes. Gracias por demostrarme ser una directora con quien puedo contar, tanto
profesional como personalmente.
A mis co-directores:
- Dr. Rodolfo G. Goya, por abrirme las puertas de su laboratorio y ayudarme a comprender el mundo
de la ciencia.
- Dr. Gustavo R. Morel, por acompañar mi crecimiento académico y estar siempre dispuesto a
compartir sus conocimientos con una gran amabilidad.
A mis excelentes compañeros de equipo, Dr. Joaquín Pardo, Natalia Scelsio, Lucía Trípodi y Juliette
López Hanotte, por su amistad y compromiso. Gracias por remar juntos en la misma dirección.
A todos los integrantes del INIBIOLP y de la Cátedra de Bioquímica y Biología Molecular, FCM-UNLP.
Tuve el agrado de conocer aquí a grandes personas y aprender mucho de ellas. Muy especialmente
a mis compañeros de Laboratorio, presentes y pasados:
- Dra. María José Bellini, Dra. Claudia Hereñú, Dra. Andrea Pereyra, Ignacio Schwerdt, Yolanda Sosa y
Oscar Vercellini.
- A mi querido grupo del altillo, Eugenia Falomir Lockhart, Araceli Bigres, Marianne Lehmann, Franco
Dolcetti, Martina Canatelli Mallat y Priscila Chiavellini.
Es reconfortante tener amigos en el lugar de trabajo y encontrar siempre un abrazo y un mate
disponibles. Mejor aún, es elegir seguir compartiendo momentos juntos por fuera de las paredes del
Laboratorio, donde las risas y las birras nos unen.
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Finalmente, mi mayor agradecimiento a mi familia:
- A Manuel Orbea, la persona más importante en mi vida, quien me sorprende a diario con su amor
y alegría. Gracias por iluminarme siempre.
- A mis padres, Lelia Villar y José Luis Zappa, mis grandes ejemplos de solidaridad y esfuerzo. Gracias
por apoyarme en mis decisiones y alentarme con tanto amor.
- A mis adorados hermanos, Verónica, Luis y Cecilia, por ser incondicionales. Gracias Ceu por estar
firme a mi lado en esta etapa y ser mi cómplice.
- A mis hermanas de la vida. Con ustedes no hay distancias porque caminan conmigo, atentas a cada
paso. Gracias por su inmejorable amistad.
- A mis sobrinos y ahijados, por llenarme el corazón y recordarme las cosas importantes de la vida.

A todos… MUCHAS GRACIAS.

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Dedicada a la memoria de mi querida abuela Esperia,
por su inmensa confianza en mí.

El motor de la ciencia es la curiosidad con las preguntas constantes: “¿Y eso cómo es?”, “¿en qué
consiste?”, “¿cómo funciona?”. Y lo más fascinante es que cada respuesta trae consigo nuevas
preguntas. En eso los científicos le llevamos ventaja a los exploradores: cuando creemos haber llegado
a la meta anhelada, nos damos cuenta de que lo más interesante es que hemos planteado nuevos
problemas para explorar.

César Milstein (Argentina, 1927 – Reino Unido, 2002)
Premio Nobel de Medicina 1984

5
TRABAJOS CIENTÍFICOS DERIVADOS DE ESTA TESIS

Parte de los resultados de la presente Tesis Doctoral han sido publicados en artículos de revistas
científicas internacionales con referato:

MESENCHYMAL STEM CELL THERAPY IMPROVES SPATIAL MEMORY AND DIMINISHED MICROGLIAL
ACTIVATION IN AGING RATS
Zappa Villar MF, Lehmann M, García MG, Mazzolini G, Morel GR, Cónsole GM, Podhajcer O, Reggiani
PC, Goya RG.
Behav. Brain Res. Under review, Nov/2018.

MESENCHYMAL STEM CELLS THERAPY IMPROVED THE STREPTOZOTOCIN-INDUCED HIPPOCAMPAL
AND BEHAVIORAL IMPAIRMENT IN RATS
Zappa Villar MF, López Hanotte J, Pardo J, Morel GR, Mazzolini G, García MG, Reggiani PC.
Neurobiol. Aging. Under review, Nov/2018.

INTRACEREBROVENTRICULAR STREPTOZOTOCIN INDUCES IMPAIRED BARNES MAZE SPATIAL
MEMORY AND REDUCES ASTROCYTE BRANCHING IN THE CA1 AND CA3 HIPPOCAMPAL REGIONS
Zappa Villar MF, López Hanotte J, Falomir Lockhart E, Trípodi LS, Morel GR, Reggiani PC.
J Neural Transm (Vienna). 2018 Sep 22. doi: 10.1007/s00702-018-1928-7.

A NEW ADENOVECTOR SYSTEM FOR IMPLEMENTING THYMULIN GENE THERAPY FOR
INFLAMMATORY DISORDERS
Zappa Villar MF, López León M, Pardo J, Costa M, Crespo R, Dardenne M, Goya RG, Reggiani PC.
Mol Immunol. 2017 Jul;87:180-187. doi: 10.1016/j.molimm.2017.04.014. Epub 2017 May 11.

THE THYMULIN-LACTOTROPIC AXIS IN RODENTS: THYMECTOMY, IMMUNONEUTRALIZATION AND
GENE TRANSFER STUDIES
Martines EV, Reggiani PC, Camihort G, Luna G, Zappa MF, Brown OA, Goya RG, Cónsole GM.
Neuroimmunomodulation. 2013;20(5):256-63. doi: 10.1159/000346477. Epub 2013 Jul 9.

PHISIOLOGY, MOLECULAR BIOLOGY AND THERAPEUTIC POTENCIAL OF THE THYMIC PEPTIDE
THYMULIN.
Pardo J, Schwerdt JI, Reggiani PC, Zappa MF, Pereyra AS, Brown OA, Goya RG. Physiological Mini-
Reviews.2012;6(1):6-12.

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Parte de los resultados de la presente Tesis Doctoral han sido comunicados en reuniones científicas
nacionales e internacionales:

INTRAVENOUS MESENCHYMAL STEM CELLS ADMINISTRATION AS A NEUROPROTECTIVE THERAPY IN A RAT
MODEL OF SPORADIC ALZHEIMER'S DISEASE (Poster). Zappa Villar MF, Lopez Hanotte J, Pardo J, Morel GR,
García MG, Reggiani PC. 48th Annual Meeting, Society for Neuroscience 2018. San Diego, CA, Estados Unidos.

POTENCIAL TERAPÉUTICO DE LAS CÉLULAS MESENQUIMALES Y DEL FACTOR DE CRECIMIENTO INSULÍNICO
TIPO 1 EN UN MODELO ANIMAL DE LA ENFERMEDAD DE ALZHEIMER (Disertante). Zappa Villar MF, Lopez
Hanotte J, Morel GR, Trípodi LS, García MG, Reggiani PC. XXI Congreso Argentino de la Enfermedad de
Alzheimer y otros Trastornos Cognitivos 2018. Facultad de Medicina, Universidad Nacional de Buenos Aires
(UBA), Buenos Aires, Argentina.

IGF-1 GENE TRANSFER PROTECTS AGAINST Aβ OLIGOMER-INDUCED NEURONAL DAMAGE AND MEMORY
IMPAIRMENT IN MICE (Poster). Sellés MC*, Zappa Villar MF*, Reggiani PC, Ferreira ST. 47th Annual Meeting,
Society for Neuroscience 2017. Washington, DC, Estados Unidos. *Igual colaboración.

NEUROPROTECTIVE CELL THERAPY IN A SPORADIC ALZHEIMER RAT MODEL (Poster). Zappa Villar MF, Morel
GR, Trípodi LS, Lopez Hanotte J, García MG, Reggiani PC. 11th Annual Canadian Neuroscience Meeting 2017.
Montreal, QC, Canadá.

THERAPEUTIC POTENTIAL OF HUMAN MESENCHYMAL STEM CELLS AND INSULIN-LIKE GROWTH FACTOR-I
GENE THERAPY IN ANIMAL MODELS OF NEURODEGENERATION (Young Investigators Symposia). Zappa Villar
MF, Morel GR, García MG, Pardo J, López León M, Trípodi LS, Mazzolini G, Goya RG, Reggiani PC. 2nd
Federation of Latin American and Caribbean Neuroscience Societies (FALAN) Congress 2016. Buenos Aires,
Argentina.

NEUROPROTECTIVE POTENTIAL OF INSULIN-LIKE GROWTH FACTOR 1 IN A RAT MODEL OF SPORADIC
ALZHEIMER'S DISEASE (Poster). Zappa Villar MF, López Hanotte J, Trípodi LS, Morel GR, Reggiani PC. XXXII
Congreso Anual de la Sociedad Argentina de Investigación en Neurociencias (SAN) 2017. Mar del Plata,
Argentina.

ESTUDIO MORFOMÉTRICO DEL HIPOCAMPO CEREBRAL DE ANIMALES CON ENFERMEDAD DE ALZHEIMER
EXPERIMENTAL (Poster). Florencia Zappa Villar MF, López Hanotte J, Pardo J, Crespo R, Morel GR, Trípodi LS,
Cónsole GM, Reggiani PC. Jornadas de Presentación de Trabajos Medicina 2017, FCM – UNLP 2017. La Plata,
Argentina.

THERAPEUTIC POTENTIAL OF HUMAN MESENCHYMAL STEM CELLS IN A SPORADIC ALZHEIMER RAT MODEL
(Poster). Zappa Villar MF; Morel GR; Trípodi LS; García M; Goya RG; Reggiani PC. XXX Congreso Anual de la
Sociedad Argentina de Investigación en Neurociencias (SAN) 2015. Mar del Plata, Argentina.

SISTEMA GÉNICO REGULABLE BIDIRECCIONAL PARA TIMULINA Y GFP: CARACTERIZACIÓN IN VIVO DE SU
FUNCIONALIDAD Y REGULABILIDAD (Poster). Zappa Villar M.; López León M.; Pardo J.; Reggiani P. LVIII Reunión
Científica Anual, Sociedad Argentina de Investigación Clínica (SAIC) 2013. Mar del Plata, Argentina.
7
INDICE
ABREVIATURAS ........................................................................................................................... 12
RESUMEN .................................................................................................................................... 15
CAPÍTULO I: INTRODUCCIÓN ....................................................................................................... 18
1.1 Envejecimiento ................................................................................................................ 18
1.1.1 Epidemiología .............................................................................................................. 18
1.1.2 Envejecimiento cerebral no patológico ......................................................................... 19
1.1.3 Alteraciones cognitivas ................................................................................................ 19
1.1.4 Señalización de la insulina y metabolismo energético cerebral ..................................... 20
1.1.5 Neuroinflamación ........................................................................................................ 21
1.1.6 Comparación de la fisiopatología entre el envejecimiento cerebral no patológico y la
Enfermedad de Alzheimer .................................................................................................... 24
1.2 Enfermedad de Alzheimer ................................................................................................ 25
1.2.1 Generalidades .............................................................................................................. 25
1.2.2 Epidemiología y costos ................................................................................................. 25
1.2.3 Factores genéticos y de riesgo ...................................................................................... 26
1.2.4 Patología ...................................................................................................................... 28
1.3 Modelos animales ............................................................................................................ 34
1.3.2 Modelo animal de la enfermedad de Alzheimer esporádica: STZ-icv ............................. 34
1.3.3 Modelos experimentales generados por oligómeros de βA .......................................... 38
1.4 Estrategias terapéuticas ................................................................................................... 40
1.4.1 Células madre: conceptos generales ............................................................................. 40
1.4.2 Terapia génica .............................................................................................................. 47
1.4.3 Factores Tróficos .......................................................................................................... 53
CAPÍTULO II: HIPÓTESIS Y OBJETIVOS .......................................................................................... 60
2.1 Hipótesis .......................................................................................................................... 60
2.2 Objetivos específicos ........................................................................................................ 60
CAPÍTULO III: TERAPIA CELULAR EN EL MODELO IN VIVO DE ENVEJECIMIENTO, LA RATA SENIL
(Objetivo específico 1) ................................................................................................................. 62
3.1 Reseña introductoria ........................................................................................................ 62
3.2 Materiales y métodos ...................................................................................................... 62
3.2.1. Aislamiento y caracterización de las hBM-MSCs .......................................................... 62
3.2.2. Marcación fluorescente de las MSCs ........................................................................... 63
3.2.3. Animales y diseño experimental ................................................................................. 63
3.2.4. Diseño del estudio temporal ....................................................................................... 64
3.2.5. Inyecciones estereotáxicas .......................................................................................... 65
3.2.6. Evaluación de la memoria espacial .............................................................................. 65
3.2.7. Eutanasia y procesamiento de los cerebros ................................................................. 67
3.2.8. Inmunohistoquímica ................................................................................................... 68
3.2.9. Obtención y análisis de imágenes ................................................................................ 68
3.2.10. Análisis de neuroblastos ............................................................................................ 68
3.2.11. Análisis de células microgliales .................................................................................. 69
3.2.12. Análisis de Western Blot ........................................................................................... 70
3.3 Resultados ....................................................................................................................... 71
3.3.1 Estudio temporal de las MSCs en los ventrículos cerebrales ......................................... 71
3.3.2 Efecto del tratamiento con MSCs en la cognición de las ratas seniles ........................... 72
8
3.3.3 Efecto del tratamiento con MSCs en el hipocampo de ratas seniles .............................. 75
3.4 Discusión.......................................................................................................................... 77
CAPÍTULO IV: CARACTERIZACIÓN DEL MODELO IN VIVO DE ENFERMEDAD DE ALZHEIMER
ESPORÁDICA INDUCIDO POR LA ADMINISTRACIÓN INTRACEREBROVENTRICULAR DE
ESTREPTOZOTOCINA EN RATAS (Objetivo específico 2) ............................................................... 81
4.1 Reseña Introductoria........................................................................................................ 81
4.2 Materiales y métodos ...................................................................................................... 81
4.2.1 Animales ...................................................................................................................... 81
4.2.2 Procedimientos quirúrgicos .......................................................................................... 81
4.2.3 Evaluación de la memoria espacial ............................................................................... 82
4.2.4 Evaluación de la memoria de reconocimiento .............................................................. 83
4.2.5 Diseño experimental .................................................................................................... 83
4.2.6 Procesamiento de los cerebros ..................................................................................... 84
4.2.7 Inmunohistoquímica .................................................................................................... 85
4.2.8 Obtención y análisis de imágenes ................................................................................. 85
4.2.9 Volumen del Stratum Radiatum ................................................................................... 85
4.2.10 Análisis de neuronas maduras .................................................................................... 86
4.2.11 Análisis de células microgliales ................................................................................... 86
4.2.12 Análisis de células astrogliales .................................................................................... 86
4.2.13 Análisis de Western Blot ............................................................................................ 87
4.2.14 Análisis estadístico ..................................................................................................... 87
4.3 Resultados ....................................................................................................................... 87
4.3.1 Reducción del peso corporal en las ratas tratadas con STZ ........................................... 87
4.3.2 Efecto de la administración de STZ-icv en el aprendizaje y la memoria de referencia
espacial en ratas ................................................................................................................... 88
4.3.3 Deterioro de la memoria de reconocimiento en ratas tratadas con STZ-icv .................. 91
4.3.4 Cambios morfológicos en el hipocampo de ratas tratadas con STZ-icv .......................... 92
4.3.5 Efecto del tratamiento STZ-icv en los niveles proteicos de PPA, βA y pTau/Tau en el
hipocampo de las ratas ......................................................................................................... 98
4.4 Discusión.......................................................................................................................... 99
CAPÍTULO V: TERAPIA CELULAR EN EL MODELO IN VIVO DE ENFERMEDAD DE ALZHEIMER
ESPORÁDICA INDUCIDO POR LA ADMINISTRACIÓN INTRACEREBROVENTRICULAR DE
ESTREPTOZOTOCINA EN RATAS (Objetivo específico 3) ............................................................. 106
5.1 Reseña Introductoria...................................................................................................... 106
5.2 Materiales y métodos .................................................................................................... 106
5.2.1 Animales .................................................................................................................... 106
5.2.2 Aislamiento y caracterización de las hUCPVCs ............................................................ 107
5.2.3 Inyecciones estereotáxicas e intravenosas ................................................................. 107
5.2.4 Comportamiento exploratorio y de ansiedad ............................................................. 107
5.2.5 Evaluación de la memoria espacial ............................................................................. 108
5.2.6 Comportamiento defensivo de enterramiento ........................................................... 108
5.2.7 Comportamiento depresivo ....................................................................................... 108
5.2.8 Diseño experimental .................................................................................................. 109
5.2.9 Procesamiento de los cerebros, inmunohistoquímica y análisis de imágenes ............. 109
5.2.10 Análisis estereológicos en el hipocampo dorsal ........................................................ 110
5.2.11 Análisis de Western Blot .......................................................................................... 110
5.2.12 Análisis estadístico ................................................................................................... 110
9
5.3 Resultados ..................................................................................................................... 110
5.3.1. Restauración del comportamiento exploratorio y la ansiedad ................................... 110
5.3.2. Restauración del aprendizaje y la memoria espacial .................................................. 111
5.3.3. Evaluación del comportamiento innato de enterramiento defensivo y del
comportamiento depresivo ................................................................................................ 113
5.3.4. Evaluación de volumen, las neuronas maduras y la neurogénesis en el hipocampo ... 114
5.3.5. Cambios en la microgliosis y la astrogliosis en el hipocampo ..................................... 116
5.3.6. Niveles de proteínas sinápticas en el hiocampo ......................................................... 118
5.3.7. Identificación de correlaciones entre comportamiento, morfología y expresión de
proteínas sinápticas en el hipocampo ................................................................................. 119
5.4. Discusión....................................................................................................................... 120
CAPÍTULO VI: TRANSFERENCIA GÉNICA DE IGF-1 EN MODELOS IN VITRO E IN VIVO DE
ENFERMEDAD DE ALZHEIMER, INDUCIDOS POR OLIGÓMEROS DEL PÉPTIDO BETA-AMILOIDE
(Objetivo específico 4) ............................................................................................................... 126
6.1 Reseña introductoria ...................................................................................................... 126
6.2 Materiales y Métodos .................................................................................................... 127
6.2.1 Preparación y caracterización de los OβAs ................................................................. 127
6.2.2 Cultivos neuronales .................................................................................................... 127
6.2.3 Medición de viabilidad celular .................................................................................... 128
6.2.4 Medición de las especies reactivas del oxígeno .......................................................... 129
6.2.5 Inmunocitoquímica y marcación con faloidina ........................................................... 129
6.2.6 Animales e inyecciones intracerebroventriculares ...................................................... 130
6.2.7 Evaluación de la memoria de reconocimiento ............................................................ 131
6.2.8 Evaluación del comportamiento depresivo................................................................. 132
6.2.9 Diseño experimental .................................................................................................. 132
6.2.10 Procesamiento de los cerebros ................................................................................. 133
6.2.11 Inmunohistoquímica e inmunofluorescencia ............................................................ 133
6.2.12 Obtención de imágenes ............................................................................................ 133
6.2.13 Volumen del Stratum Radiatum y del Dentate Hilus ................................................. 134
6.2.14 Análisis de neuroblastos y células gliales hipocampales ........................................... 134
6.2.15 Análisis de Western Blot para IGF-1 .......................................................................... 134
6.2.16 Análisis estadístico ................................................................................................... 134
6.3 Resultados ..................................................................................................................... 135
6.3.1 Viabilidad de los cultivos neuronales transducidos con el vector adenoviral y expuestos
a OβAs ................................................................................................................................ 135
6.3.2 Niveles del receptor de IGF-1 no alterados en la superficie neuronal por exposición a
OβAs in vitro ....................................................................................................................... 135
6.3.3 Prevención del aumento de especies reactivas del oxígeno inducido por los OβAs in
vitro .................................................................................................................................... 136
6.3.4 Protección parcial de la pérdida de espinas dendríticas inducida por los OβAs in vitro
........................................................................................................................................... 137
6.3.5 Reducción de la unión de OβAs a las neuronas in vitro ............................................... 137
6.3.6 Protección in vivo de la pérdida de memoria en ratones expuestos a OβAs ................ 138
6.3.7 Evaluación del comportamiento depresivo en ratones expuestos a OβAs .................. 139
6.3.8 Aumento in vivo de los niveles de IGF-1 en el hipocampo........................................... 140
6.3.9 Cambios morfológicos en el hipocampo de los ratones expuestos a OβAs .................. 141
6.4 Discusión........................................................................................................................ 144
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