ontwikkeling van een hplc-methode ter bepaling van ergosterol met oog op fusarium-kwantificatie ...

58 Pages·2010·0.62 MB·English

UNIVERSITEIT GENT

FACULTEIT FARMACEUTISCHE WETENSCHAPPEN

Vakgroep Bioanalyse

Laboratorium voor Bromatologie

Academiejaar 2009-2010

ONTWIKKELING VAN EEN HPLC-METHODE

TER BEPALING VAN ERGOSTEROL MET OOG

OP FUSARIUM-KWANTIFICATIE IN GRANEN

Jeroen SENAEVE

Eerste Master in de Geneesmiddelenontwikkeling

Interne Promotor
Prof. S. De Saeger

Externe Promotor
Ing. P. Maene, Hogeschool Gent

Commissarissen
Dr. J. Diana Di Mavungu
Dr. L. Vanhaecke

UNIVERSITEIT GENT

FACULTEIT FARMACEUTISCHE WETENSCHAPPEN

Vakgroep Bioanalyse

Laboratorium voor Bromatologie

Academiejaar 2009-2010

ONTWIKKELING VAN EEN HPLC-METHODE

TER BEPALING VAN ERGOSTEROL MET OOG

OP FUSARIUM-KWANTIFICATIE IN GRANEN

Jeroen SENAEVE

Eerste Master in de Geneesmiddelenontwikkeling

Interne Promotor
Prof. S. De Saeger

Externe Promotor
Ir. P. Maene, Hogeschool Gent

Commissarissen
Dr. J. Diana Di Mavungu
Dr. L. Vanhaecke
Auteursrecht

“De auteur en de promotor geven de toelating deze masterproef voor
consultatie beschikbaar te stellen en delen ervan te kopiëren voor
persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt onder de beperkingen van het
auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de verplichting
uitdrukkelijk de bron te vermelden bij het aanhalen van de resultaten uit
deze masterproef.”

Gent, mei 2010.

De promotor, De auteur,

Prof. S. De Saeger Jeroen Senaeve
Woord vooraf

Deze masterproef is het resultaat van een semester lang onderzoek in het
laboratorium voor biowetenschappen en landschapsarchitectuur aan de
Hogeschool Gent. Verschillende personen wil ik bedanken voor hun inzet
en toewijding gedurende deze periode.

Vooreerst wil ik Prof. Sarah De Saeger bedanken voor het nalezen en
corrigeren van mijn werk. In het bijzonder dank ik mijn externe promotor,
Ir. Peter Maene, voor het opvolgen en begeleiden van mijn masterproef.
Ook bedank ik graag Dr. Ir. Kris Audenaert voor de verschillende
schimmelstalen die ter beschikking gesteld werden, en Kirsten Willems
voor de vlotte samenwerking in het laboratorium.

Daarnaast richt ik een woord van dank aan mijn ouders die mij de kans
gegeven hebben om hogere studies aan te vatten. Tenslotte wil ik ook
mijn kotgenoten en vrienden bedanken voor de steun en de vele fijne
momenten.

Jeroen Senaeve
Gent, mei 2010
1. INLEIDING .................................................................................................................1

2. OBJECTIEVEN ...........................................................................................................3

3. LITERATUURSTUDIE .............................................................................................6

3.1 FUSARIUM ...............................................................................................................6

3.1.1. Inleiding ......................................................................................................6
3.1.2. Voorkomen .................................................................................................6
3.1.3. Pathogeniciteit .........................................................................................7
3.1.3.1 Mycotoxines ............................................................................................7
3.1.3.2 Aantasting van de gewassen .............................................................8
3.1.3.3 Gevaar voor de mens ..........................................................................9

3.2. ASPERGILLUS ..................................................................................................... 11

3.2.1. Inleiding .................................................................................................... 11
3.2.2. Voorkomen ............................................................................................... 12
3.2.3. Pathogeniciteit ....................................................................................... 13

3.3 ERGOSTEROL ....................................................................................................... 14

3.3.1. Inleiding .................................................................................................... 14
3.3.2. Biosynthese in schimmels ................................................................ 15
3.3.3. Ergosterol als maat voor schimmelaantasting ..................... 16

3.4. ACHTERGRONDINFORMATIE BIJ DE EXTRACTIE .................................... 17

3.4.1. Inleiding .................................................................................................... 17
3.4.2. Extractieprocedure voor ergosterol uit graan ....................... 18
3.4.2.1. Verzepingsreactie .............................................................................. 18
3.4.2.2. Fysisch verstoren van de celwand ............................................... 18
3.4.2.3. Extractie en opzuivering .................................................................. 19

3.5 ANALYSEMETHODEN ......................................................................................... 20

4. MATERIAAL EN METHODEN ............................................................................. 22

4.1. LIJST VAN GEBRUIKTE TOESTELLEN EN REAGENTIA ........................... 22

4.1.1. Toestellen ................................................................................................. 22
4.2.2. Reagentia .................................................................................................. 22

4.2 METHODEN ........................................................................................................... 23

4.2.1. Schimmelgroei ....................................................................................... 23
4.2.2. HPLC ............................................................................................................ 24
4.2.2.1. Standaardreeksen ............................................................................. 24
4.2.2.2. De extracties ....................................................................................... 26

5. DISCUSSIE ............................................................................................................... 28

5.1. RESULTATEN VAN DE HPLC-ANALYSE........................................................ 28

5.1.1. De standaardcurves ............................................................................ 28
5.1.1.1. De eerste standaardcurve ............................................................... 28
5.1.1.2. De tweede standaardcurve ............................................................. 30
5.1.1.3. De derde standaardcurve ................................................................ 31
5.1.1.4. De vierde standaardcurve: berekening van de extractie-
efficiëntie ............................................................................................................... 31
5.1.1.5. De vijfde standaardcurve: tweede berekening van de
extractie-efficiëntie ............................................................................................ 33

5.1.2. De extractieprocedures ..................................................................... 34
5.1.2.1. De eerste extractie ............................................................................ 34
5.1.2.2. De tweede extractie .......................................................................... 34
5.1.2.3. De derde extractie ............................................................................. 35
5.1.2.4. De vierde extractie ............................................................................ 36

5.2. VALIDATIE VAN DE STANDAARDCURVE .................................................... 37

5.2.1. Inleiding .................................................................................................... 37
5.2.2. Lineariteit ................................................................................................. 38
5.2.3. Detectielimiet ......................................................................................... 38
5.2.4. Kwantificatielimiet ............................................................................... 38
5.2.5. Bereik .......................................................................................................... 39
5.2.6. Juistheid .................................................................................................... 39
5.2.7. Precisie ...................................................................................................... 39
5.2.7.1. Herhaalbaarheid ................................................................................. 40
5.2.7.2. Reproduceerbaarheid ....................................................................... 40
5.2.8. Recovery.................................................................................................... 41

6. CONCLUSIE .............................................................................................................. 42

7. LITERATUURLIJST ................................................................................................ 43
Lijst met gebruikte afkortingen

7-DHC 7-Dehydrocholesterol
°C Graden Celsius
µg Microgram
µm Micrometer
An. Analyt
ATA Voedingsgerelateerde Toxische Aleukia
ATP Adenosinetrifosfaat
BMT Beenmergtransplantatie
CH OH Methanol
3
Cx Keten van x aantal koolstofatomen
Cl- Chloride-ion
cm Centimeter
Con. Controle
DMP Dimethylallylpyrofosfaat
DNA Desoxyribonucleïnezuur
DON Deoxynivalenol
g Gram
GC Gaschromatografie
FD Fluorescentiedetector
FHB Fusarium Head Blight
H+ Waterstof-ion
H O Water
2
HCl Waterstofchloride / Zoutzuur
HMG-CoA 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coënzyme A
HPLC Hoge Performantie Vloeistofchromatografie
IPP Isopentenylpyrofosfaat
kg Kilogram
KOH Kaliumhydroxide
LAF Laiminaire Air Flow kast
LOD Detectielimiet
LOQ Kwantificatielimiet
MAE Microwave-Assisted Extraction
MG Moleculair Gewicht
mg Milligram
min. Minu(u)t(en)
mL Milliliter
MS Massaspectrometrie
N Stikstof
2
Na+ Natrium-ion
NaCL Natriumchloride
NADPH Nicotinamide Adenine Dinucleotide Fosfaat
NaOH Natriumhydroxide
nm Nanometer
OH- Hydroxide-ion
OTA Ochratoxine A
PDA Potato Dextrose Agar
pH Zuurtegraad
ppm Parts Per Million
PT Post-transplantatie
QPCR Quantitative Polymerase Chain Reaction
R2 Correlatiecoëfficiënt
rRNA Ribosomaal Ribonucleïnezuur
s Seconde(n)
SOT Solid-Organ Transplantation
spp. Species
TDI Toegelaten Dagelijkse Inname
(HP)TLC (Hoge Performantie) Dunnelaagchromatografie
TMCS Trimethylchlorosilaan
TMSI Trimethylsilylimidazole
UHT Ultra High Temperature Processing
UPLC Ultra Performantie Vloeistofchromatografie
UV Ultraviolet
V.D. Velddosis
VWD Variabele Golflengte Detector
W Watt
WWB Warmwaterbad
ZEA Zearalenone
1. INLEIDING

Contaminatie van graan door schimmels is van groot economisch belang. Gewassen
kunnen gedurende verschillende stadia in de verwerking besmet worden door schimmels.
Schimmelaantasting gaat in vele gevallen gepaard met oogstverliezen. Dit heeft een
belangrijk nadelig gevolg voor bevolkingsgroepen die voor hun alledaags dieet in grote
mate afhankelijk zijn van graansoorten (bv. de Aziatische landen, waar rijst een
belangrijke voedingscomponent is).

Naast deze wereldwijde complicatie speelt graancontaminatie nog een belangrijke rol in
een ander grootschalig probleem. De schimmels die groeien op graansoorten produceren
in sommige gevallen schadelijke, secundaire metabolieten. Deze metabolieten worden
mycotoxines genoemd en zijn vaak de oorzaak van verschillende aandoeningen die
voorkomen bij de mens. Voorbeelden zijn ochratoxine A (OTA), deoxynivalenol (DON) en
zearalenone (ZEA). Er wordt geschat dat ongeveer een kwart van alle landbouwgewassen
een zekere hoeveelheid aan mycotoxines bevat. De concentratie ervan in graan varieert
naargelang het soort mycotoxine. Zo wordt voor OTA, DON en ZEA een mediaan
gevonden van respectievelijk 0,021; 5,5 en 0,2 µg/g (Tangni & Pussemier, 2007). Het is
van groot belang dat de schimmelaantasting van de gewassen tot een minimum herleid
wordt.

Fusarium en Aspergillus zijn de twee schimmelsoorten die centraal staan in dit
onderzoek. Fusarium is een veldschimmel en tast dus de planten aan tijdens het
groeiproces op het veld. Aspergillus daarentegen is een voorraadschimmel. Deze
schimmel kan het graan contamineren wanneer het opgeslagen is in silo‟s. Beide fungi
produceren mycotoxines en kunnen bijgevolg schadelijk zijn voor de mens of voor vee
dat besmet veevoeder eet. Bestrijding van deze schimmels gebeurt aan de hand van
fysische (bv. straling) of chemische (fungiciden, organische zuren, ...) middelen.

Het doel van dit thesisonderzoek bestaat erin een snelle en betrouwbare methode op
punt te stellen voor de bepaling van de mate aan schimmelaantasting. Hierbij wordt
gebruik gemaakt van chromatografische methoden en principes. De schimmelaantasting
in graanstalen is gerelateerd aan de hoeveelheid ergosterol die teruggevonden wordt.
Ergosterol is het meest abundante sterol in celmembranen van schimmels. Het is
specifiek voor fungi en is relatief eenvoudig en snel te bepalen met behulp van
chromatografische procedures.

1