Molekulare Analysen zur Knochenregeneration im Alter und bei Osteoporose

202 Pages·2011·9.88 MB·German

Molekulare Analysen zur Knochenregeneration
im Alter und bei Osteoporose

Dissertation zur Erlangung des
naturwissenschaftlichen Doktorgrades
der Julius-Maximilians-Universität

Würzburg

vorgelegt von
Peggy Benisch
geboren in Zeitz

Würzburg, 2011
Eingereicht am:

Mitglieder der Promotionskommission:
Vorsitzender: Prof. Dr. Thomas Dandekar
Gutachter: Prof. Dr. Franz Jakob
Gutachter: Prof. Dr. Georg Krohne

Tag des Promotionskolloquiums:

Doktorurkunde ausgehändigt am:
Hiermit erkläre ich ehrenwörtlich, dass ich die vorliegende Dissertation selbstständig angefertigt und
keine anderen als die von mir angegebenen Hilfsmittel und Quellen verwendet habe.
Des Weiteren erkläre ich, dass diese Arbeit weder in gleicher noch in ähnlicher Form in einem
Prüfungsverfahren vorgelegen hat und ich noch keinen Promotionsversuch unternommen habe.

Würzburg, 04.03.2011

Peggy Benisch
Inhaltsverzeichnis

1 Zusammenfassung ........................................................................................................................... 1
2 Summary.......................................................................................................................................... 2
3 Einleitung ......................................................................................................................................... 3
3.1 Knochenhomöostase ............................................................................................................... 3
3.1.1 Knochenumbau ................................................................................................................... 4
3.1.1.1 Knochenabbau ............................................................................................................. 4
3.1.1.2 Knochenaufbau............................................................................................................ 5
3.1.2 Quelle der Regeneration: Mesenchymale Stammzellen (MSC) .......................................... 7
3.1.3 Steuerung des Knochenumbaus .......................................................................................... 8
3.1.3.1 WNT-Signalweg ........................................................................................................... 8
3.1.3.2 BMP-Signalweg ............................................................................................................ 9
3.1.3.3 Wachstumsfaktoren .................................................................................................. 10
3.1.3.4 Mechanotransduktion ............................................................................................... 12
3.1.3.5 Hormonelle Steuerung .............................................................................................. 13
3.2 Alterung ................................................................................................................................. 15
3.2.1 Alterung des Organismus .................................................................................................. 15
3.2.2 Zelluläre Seneszenz ........................................................................................................... 15
3.2.3 Ursachen für Alterung ....................................................................................................... 17
3.2.3.1 Telomere ................................................................................................................... 17
3.2.3.2 DNA- Reparatur ......................................................................................................... 17
3.2.3.3 Oxidativer Stress ........................................................................................................ 18
3.2.3.4 Proliferationsstress und Mitogene ............................................................................ 18
3.2.3.5 Epigenetik .................................................................................................................. 19
3.2.3.6 Genetische Prädisposition ......................................................................................... 20
3.2.4 Immunseneszenz ............................................................................................................... 20
3.2.5 Auswirkung der Alterung auf Knochenhomöostase .......................................................... 22
3.2.5.1 Auswirkungen der Alterung auf MSC ........................................................................ 22
3.3 Osteoporose .......................................................................................................................... 24
3.3.1 Gestörte Knochenhomöostase bei Osteoporose .............................................................. 24
3.3.2 Ursachen für Osteoporose ................................................................................................ 24
3.3.2.1 Alterung ..................................................................................................................... 24
3.3.2.2 Veränderungen im Hormonspiegel ........................................................................... 24
3.3.2.3 Verhalten ................................................................................................................... 25
3.3.2.4 Genetik ...................................................................................................................... 25
3.3.3 MSC und Osteoporose ....................................................................................................... 26
3.4 Ziel der Arbeit ........................................................................................................................ 26
4 Material und Methoden ................................................................................................................ 27
4.1 Material ................................................................................................................................. 27
4.1.1 Geräte ................................................................................................................................ 27
4.1.2 Verbrauchsmaterial ........................................................................................................... 28
4.1.3 Chemikalien/ Reagenzien .................................................................................................. 28
4.1.4 Kits ..................................................................................................................................... 30
4.1.5 Primer ................................................................................................................................ 31
4.1.5.1 Primer für semi-quantitative PCR .............................................................................. 31
4.1.5.2 Sequenzierungsprimer .............................................................................................. 33
4.1.6 Enzyme .............................................................................................................................. 33
4.1.7 Antikörper.......................................................................................................................... 33
4.1.7.1 Primärantikörper ....................................................................................................... 33
4.1.7.2 Sekundärantikörper ................................................................................................... 34
4.1.8 Proteine ............................................................................................................................. 34
4.1.9 Kompetente Bakterien ...................................................................................................... 34
4.1.10 Vektoren ........................................................................................................................ 35
4.1.11 Software und Internet-Seiten ........................................................................................ 35
4.1.1 Lösungen für Molekularbiologie und Proteinbiochemie ................................................... 36
4.1.2 Bakteriennährmedien/-nährboden ................................................................................... 39
4.1.3 Zellkulturmedien ............................................................................................................... 39
4.2 Methoden .............................................................................................................................. 40
4.2.1 Molekularbiologische Methoden ...................................................................................... 40
4.2.1.1 Isolation von zellulärer RNA ...................................................................................... 40
4.2.1.2 Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren ....................................................... 40
4.2.1.3 Reverse Transkription ................................................................................................ 40
4.2.1.4 Semi-quantitative Polymerase Kettenreaktion (PCR) ............................................... 41
4.2.1.5 Agarosegelelektrophorese ........................................................................................ 42
4.2.1.6 Densitometrie ............................................................................................................ 42
4.2.1.7 Agarosegel-Eluation................................................................................................... 42
4.2.1.8 DNA-Sequenzierung .................................................................................................. 43
4.2.1.9 Methoden der Klonierung von DNA-Sequenzen ....................................................... 44
4.2.1.10 Klonierung für die Expression von SAA1 und SAA2 ................................................... 45
4.2.1.11 Präparation von Plasmid-DNA ................................................................................... 46
4.2.2 Zellbiologische Methoden ................................................................................................. 47
4.2.2.1 Isolierung von humanen mesenchymalen Stammzellen (hMSC) .............................. 47
4.2.2.2 Kultivierung von eukaryotischen Zellen .................................................................... 47
4.2.2.3 Bestimmung der Zellzahl und Berechnung der Populationsverdopplung ................. 48
4.2.2.4 In vitro-Alterung von hMSC ....................................................................................... 48
4.2.2.5 Kryokonservierung von hMSC-TERT .......................................................................... 48
4.2.2.6 Osteogene Differenzierung von hMSC und hMSC-TERT ........................................... 48
4.2.2.7 Applikation von rekombinantem, humanem SAA1 in der Zellkultur ........................ 49
4.2.2.8 Stabile Transfektion von hMSC-TERT ........................................................................ 49
4.2.3 Protein-biochemische Methoden ...................................................................................... 49
4.2.3.1 Isolation von zellulärem Protein ................................................................................ 49
4.2.3.2 Konzentrationsbestimmung von Proteinen .............................................................. 49
4.2.3.3 SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese (SDS-PAGE) ................................................... 50
4.2.3.4 Western-Blot ............................................................................................................. 51
4.2.3.5 Messung der Seneszenz-assoziierten β-Galaktosidase-Aktivität .............................. 51
4.2.4 Cytochemische Färbungen ................................................................................................ 52
4.2.4.1 Seneszenz-assoziierte β-Galaktosidase-Färbung ....................................................... 52
4.2.4.2 Alizarin Rot S-Färbung ............................................................................................... 52
4.2.5 Immuncytochemische Färbungen ..................................................................................... 52
4.2.6 Mikroarray-Analysen ......................................................................................................... 53
4.2.6.1 Microchip-Hybridisierung .......................................................................................... 53
4.2.6.2 Statistische Auswertung von Mikroarray-Daten ....................................................... 54
5 Ergebnisse...................................................................................................................................... 55
5.1 Mikroarray-Analysen ............................................................................................................. 55
5.1.1 Aufarbeitung der Mikroarray-Daten ................................................................................. 55
5.1.2 Mikroarray-Analysen von in-vivo-gealterten hMSC .......................................................... 56
5.1.2.1 Differentielle Genexpression in in-vivo-gealterten hMSC ......................................... 56
5.1.2.2 Statistische, funktionelle Analyse mittels GOstat ..................................................... 57
5.1.2.3 Biologische Evaluierung der Mikroarray-Ergebnisse zur in-vivo-Alterung ................ 58
5.1.3 Mikroarray-Analysen von seneszenten hMSC ................................................................... 60
5.1.3.1 Differentielle Genexpression in seneszenten hMSC ................................................. 60
5.1.3.2 Statistische, funktionelle Analyse mittels GOstat ..................................................... 61
5.1.3.3 Biologische Evaluierung der Mikroarray-Ergebnisse zur Seneszenz ......................... 62
5.1.4 Mikroarray-Analysen von Osteoporotischen hMSC .......................................................... 65
5.1.4.1 Differentielle Genexpression in hMSC-OP ................................................................. 65
5.1.4.2 Statistische, funktionelle Analyse mittels GOstat ..................................................... 65
5.1.4.3 Biologische Evaluierung der Mikroarray-Ergebnisse zur Osteoporose ..................... 66
5.1.5 Vergleich in-vivo-Alterung, Seneszenz und Osteoporose ................................................. 69
5.1.5.1 Vergleich in-vivo-Alterung und Seneszenz ................................................................ 70
5.1.5.2 Vergleich Osteoporose und in-vivo-Alterung ............................................................ 74
5.1.5.3 Vergleich Osteoporose mit Seneszenz ...................................................................... 76
5.2 Kandidatengene der Seneszenz............................................................................................. 77
5.2.1 Nachweis der Seneszenz in hMSC ..................................................................................... 77
5.2.2 Kandidatengensuche ......................................................................................................... 81
5.2.3 A-SAA – Auswirkung auf die Funktion von hMSC .............................................................. 83
5.2.3.1 Einfluss von A-SAA auf die Seneszenz ....................................................................... 83
5.2.3.2 Stimulation mit rhSAA1 während osteogener Differenzierung ................................ 84
5.2.3.3 Charakterisierung von stabil mit SAA1 bzw. SAA2 transfizierten hMSC-TERT .......... 86
5.2.4 HELLS – Expressionsmuster während der in-vitro-Alterung von hMSC ............................ 89
5.3 Kandidatengene der Osteoporose ........................................................................................ 92
5.3.1 Kandidatengensuche ......................................................................................................... 92
5.3.2 Sclerostin – prämature Expression in hMSC...................................................................... 95
6 Diskussion ...................................................................................................................................... 97
6.1 Systembiologie versus statistische Aufarbeitung der Mikroarray-Daten ............................. 97
6.2 In-vivo-Alterung ..................................................................................................................... 98
6.2.1 In-vivo-Alterung verändert das Genexpressionsmuster in hMSC ..................................... 98
6.2.1.1 Reproduzierbare Genexpressionsänderungen trotz Spendervariabilität ................. 98
6.2.1.2 Eingeschränkte Funktion von in-vivo-gealterten hMSC ............................................ 99
6.3 Seneszenz ............................................................................................................................ 100
6.3.1 In-vitro-Alterung von hMSC ist ein geeignetes Seneszenz-Modell ................................. 101
6.3.2 hMSC zeigen in Kultur bereits früh Anzeichen von Seneszenz........................................ 101
6.3.3 Seneszenz verändert das Genexpressionsmuster in hMSC ............................................. 102
6.3.3.1 Reproduzierbare Genexpressionsänderungen ........................................................ 103
6.3.3.2 Eingeschränkte Funktion von seneszenten hMSC ................................................... 103
6.3.4 Seneszenz versus Alterung .............................................................................................. 105
6.3.4.1 Wenige Überlappungen im differentiellen Genexpressionsmuster........................ 105
6.3.4.2 Ähnliche Störungen trotz unterschiedlicher Genexpressionsmuster ..................... 106
6.4 Osteoporose ........................................................................................................................ 107
6.4.1 Das Transkriptom osteoporotischer hMSC ist verändert ................................................ 107
6.4.1.1 Reproduzierbare Genexpressionsänderungen trotz Spendervariabilität ............... 107
6.4.1.2 Die Änderungen im Genexpressionsmuster sind different von Spendern gleichen
Alters ohne Osteoporose......................................................................................................... 108
6.4.2 hMSC-OP zeigen Anzeichen von Seneszenz .................................................................... 110
6.5 Mittels Mikroarray-Analysen ermittelte Kandidatengene .................................................. 111
6.5.1 A-SAA – Mineralisierungsförderer und Marker für Stress .............................................. 111
6.5.1.1 Erhöhte A-SAA-Expression: Seneszenz versus Krebs ............................................... 111
6.5.1.2 A-SAA fördert die Mineralisierung .......................................................................... 112
6.5.1.3 Stress stimuliert Expression von A-SAA und Metalloproteinasen ........................... 113
6.5.2 HELLS – Verlust der Genexpression als neuer Marker für Seneszenz ............................. 114
6.5.3 SOST – ein Marker für Osteoporose in hMSC.................................................................. 115
6.6 Zusammenfassung Diskussion ............................................................................................. 117
6.7 Ausblick................................................................................................................................ 118
7 Literaturverzeichnis ..................................................................................................................... 120
8 Anhang......................................................................................................................................... 140
8.1 Zusatzmaterial ..................................................................................................................... 140
8.1.1 SAM-Ergebnisse zur differentiellen Genexpression ........................................................ 140
8.1.1 GOstat-Analysen .............................................................................................................. 156
8.1.1 Ranglisten ........................................................................................................................ 178
8.2 Abkürzungen........................................................................................................................ 189
8.3 Abbildungsverzeichnis ......................................................................................................... 191
8.4 Tabellenverzeichnis ............................................................................................................. 192
8.5 Lebenslauf .......................................................................... Fehler! Textmarke nicht definiert.
8.6 Veröffentlichungen und Kongressbeiträge ......................................................................... 193
8.7 Danksagung ......................................................................................................................... 195
Zusammenfassung
1 Zusammenfassung

Mesenchymale Stammzellen (MSC) stellen die Grundlage der Knochenformation dar, indem sie als
multipotente Zellen in viele, für die Knochenhomöostase benötigte Zelltypen differenzieren können,
wie z.B. Osteoblasten. Während der Alterung des Menschen kommt es zu einem Ungleichgewicht
zwischen Knochenaufbau und Knochenabbau, resultierend in einer verringerten Knochenmasse.
Noch ist unklar, ob MSC an dem verminderten Knochenaufbau direkt beteiligt sind, indem sie z.B.im
Laufe der Zeit Funktionsstörungen akkumulieren oder in die Seneszenz eintreten, und somit nicht
mehr als Stammzellpool für die Osteoblastendifferenzierung zur Verfügung stehen.
In der vorliegenden Arbeit wurde das Genexpressionsmuster gealterter Zellen mittels Mikroarray-
Analysen untersucht, um die Alters-bedingten Veränderungen detektieren zu können. Hierfür wurde
ein in-vitro-Alterungsmodell von humanen MSC (hMSC) etabliert, um die seneszenten Zellen mit
hMSC früher Kultivierungspassagen zu vergleichen. Auch Zellen aus Spendern hohen Alters wurden
untersucht, um einen Vergleich zwischen ex-vivo- und in-vitro-gealterten hMSC anstellen zu können.
Da Osteoporose eine polygenetische Erkrankung des gealterten Knochens darstellt, wurden auch mit
hMSC aus Osteoporose-Patienten Genexpressionsanalysen durchgeführt.
Die Mikroarray-Analysen und anschließende systembiologische Auswertung zeigten, dass in-vitro-
gealterte, seneszente hMSC starke Veränderungen im Transkriptom aufweisen, die auf Defizite in der
Proliferation, Differenzierungskapazität und Migration schließen lassen. Neben bekannten Markern
für replikative Seneszenz konnten in hMSC auch neue detektiert werden, wie z.B. HELLS, POU5F1
(OCT4) und FGFR2, deren Expression mit der Seneszenz abnimmt, oder CDH1 und PSG5, deren
Expression zunimmt. Gene für Akute-Phase-SAA wurden stark erhöht exprimiert vorgefunden. Bei
der funktionellen Charakterisierung konnte jedoch gezeigt werden, dass SAA1 und SAA1 durch Stress
induziert werden, der der Seneszenz vorausgeht, und dass sie die Mineralisierung bei der osteogenen
Differenzierung von hMSC fördern. Akute-Phase-SAA könnten somit eine Verbindung zwischen
Alterung bzw. Inflammation und extra-skelettaler Verkalkung darstellen, die im Alter häufig auftritt,
z.B. in Form von Arteriosklerose.
In-vivo-gealterte hMSC wiesen ebenfalls Defizite im Expressionsmuster von Proliferations- und
Migrations- relevanten Genen auf. Des Weiteren konnten nur wenige Gemeinsamkeiten zwischen in-
vivo-gealterten hMSC und in-vitro-gealterten hMSC festgestellt werden. Dies lässt vermuten, dass die
in-vivo-Alterung nicht zwangsläufig zu seneszenten Stammzellen führt, da Alterung eines Organismus
ein multizellulärer Prozess ist, der durch viele Faktoren beeinflusst wird, wie z.B. Akkumulation von
Mutationen und Krebsabwehr. Auch osteoporotische hMSC wiesen Veränderungen im
Genexpressionsmuster auf, die mit den Daten zur in-vivo-Alterung verglichen wurden, um die rein
Alters-assoziierten Änderungen herausfiltern zu können. Die übrig gebliebenen Gene repräsentierten
Veränderungen allein aufgrund der Krankheit. Osteoporose bewirkte somit distinkte Genexpressions-
änderungen in hMSC, die auf Förderung der Osteoklastogenese und Defizite in Proliferation,
Migration und Differenzierungskapazität schließen lassen. Es konnten vielversprechende Kandidaten-
gene für osteoporotische hMSC gefunden werden. Die prämature Expression des WNT-Inhibitors
SOST (Sclerostin) und die Überexpression des BMP-Signalweg-Inhibitors MAB21L2 deuten auf eine
Autoinhibition der Stammzellen hin, die letztlich die gestörte Knochenformation bei Alters-
assoziierter Osteoporose begründen könnte.
Zusammenfassend zeigt die vorliegende Arbeit, dass intrinsische Defizite von Stammzellen an der
Pathophysiologie von Alterung und Osteoporose beteiligt sind. Sie eröffnet tiefgreifende Einblicke in
die systembiologischen Veränderungen in Stammzellen aufgrund von Alterung oder Osteoporose,
und setzt somit einen soliden Grundstein für weiterführende Analysen.

1
Summary
2 Summary

Mesenchymal stem cells (MSC) represent the basis of bone formation, because as multipotent cells
they can differentiate into many cell types important for bone homeostasis, e.g. osteoblasts. During
aging an imbalance between bone formation and bone resorption occurs, which results in reduced
bone mass. It is still unclear whether MSC biology is directly involved in reduced bone formation, e.g.
by accumulating malfunctions in aged organisms or by entering replicative senscence. Thereby they
would no longer function as a regenerative source for osteogenesis.
In this study, the gene expression pattern of aged human MSC (hMSC) was analyzed by microarray
hybridizations to determine aging-associated changes in those cells. Therefore, a model for in vitro
aging was established and the gene expression pattern of senescent hMSC was compared with the
pattern of hMSC in early passages. Moreover, cells isolated from patients of old age were analyzed to
perform a comparison between ex-vivo and in vivo aging. Human MSC of patients diagnosed with
osteoporosis were also examined because osteoporosis is a polygenetic disease of aged bone.
Systems biology based interpretation of the microarray data revealed changes on the mRNA level in
in vitro aged hMSC that indicate deficits in proliferation, differentiation capacity and migration.
Additionally to known markers of replicative senescence in hMSC, new markers were detected, e.g.
reduced expression of HELLS, POU5F1 (OCT4), and FGFR2, as well as higher expression of CDH1 and
PSG5. Furthermore, genes for acute phase SAA proteins showed extremely high expression in
senescent hMSC. Functional characterization of SAA1 and SAA2 revealed that the expression is rather
a consequence of stress that precedes senescence than of replicative senescence itself. SAA also
increases mineralization of osteogenic differentiated hMSC and could therefore be involved in age-
or inflammation-associated extraskeletal calcification, e.g. arteriosclerosis.
In vivo aged hMSC also showed deficiency in proliferation and migration on mRNA level. Furthermore
on the gene expression level, in vivo aged and in vitro aged hMSC shared only few similarities. Those
findings suggest that in vivo aging does not necessarily results in senescent stem cells, because the
aging of an organism is a multicellular process, which is influenced by many other factors, e.g.
accumulation of mutations and tumor defense.
Osteoporotic hMSC also showed changes in their gene expression pattern. By comparing those data
with the results of hMSC from age-matched patients, age-associated changes could be eliminated. All
remaining genes with differential expression represented osteoporosis-related changes that
indicated deficiencies in proliferation, migration and differentiation capacity. There were hints for
enhancement of osteoclastogenesis by osteoporotic hMSC and promising candidates for
osteoporosis with respect to inhibition of osteogenesis were detected. SOST (sclerostin) acts as an
inhibitor for WNT signaling and MAB21L2 as an inhibitor for BMP signaling. Both genes were
expressed to a higher extent in osteoporotic hMSC, which indicates autoinhibition of the stem cells
and could lead to the reduced bone formation in osteoporosis.
In summary, this study indicates that intrinsic alterations in stem cell biology are involved in the
pathophysiology of aging and osteoporosis. It opens up profound insights into changes in systems
biology of hMSC due to aging or osteoporosis which provide a broad basis for further analyses.

2
Einleitung
3 Einleitung

3.1 Knochenhomöostase
Knochengewebe ist eine spezialisierte Form des Bindegewebes. Es besteht hauptsächlich aus einer
mineralisierten Matrix, die sich aus miteinander verknüpften Kollagen fasern und Hydroxylapatit
(Kalziumphosphatsalz) zusammensetzt. Knochen bildet die Stütze des Körpers und stellt ein Reservoir
für Kalzium und Phosphat, sowie einen Ort für die Hämatopoese dar. Die Röhrenknochen des
Erwachsenen sind Lamellenknochen und setzten sich aus zwei Schichten zusammen: der äußeren,
kompakten Schicht Substantia compacta und einer inneren Schicht, die aus schwammartig
aufgebauten Knochenbälkchen und dem Knochenmark besteht, die Substantia spongiosa. Die
Knochenbälkchen und das Innere des Knochens sind von einer dünnen Bindegewebsschicht
umgeben, dem Endosteum. Den äußeren Knochen hüllt das dickere Periost ein. Die Untereinheiten
der knöchernen Bestandteile des Lamellenknochens sind die Osteone, dicke Lamellen parallel zur
Längsachse des Knochens, die sich aus konzentrischen Schichten um einen zentralen Kanal
zusammensetzen (Abb. 1). Dieser Kanal, auch Havers-Kanal genannt, enthält Nervenzellen und
Blutgefäße. Im Durchschnitt bestehen Osteone aus 6-7 Schichten. Diese sind ca. 4 mm lang und 200
mm breit.

Osteozyten
Substantiacompacta
Osteon
Substantiaspongiosa
Kanalikuli
Havers-Kanal
Periost Nerven
Volkmann-Kanal Blutgefäße

Abb. 1 Aufbau des Lamellenknochens nach (Bartl 2008) und (Robling and Stout 1999)

Die Osteone stehen untereinander und mit dem Endost, dem Knochenmark und dem Periost über
weitere Kanäle (Volkmann-Kanäle) in Verbindung, durch die auch der Austausch von endokrinen
Faktoren und Signalmolekülen erfolgt. Die Osteone stellen jene Einheit des Knochens dar, an der die
knochenrelevanten Zellen den Knochenumbau durchführen. Zu den Knochenzellen gehören zum
einen die Osteozyten, die sich in den konzentrischen Schichten der Osteone direkt in der
Knochenmatrix befinden. Sie sind dort in Lakunen lokalisiert, und über Gap Junctions ihrer in
Kanalikuli verlaufenden, dendritenartigen Ausläufer stehen sie untereinander in Kontakt. Die
Kanalikuli sind auch mit den Kanälen des Osteoms verbunden, wodurch die Kommunikation der
Zellen mit den restlichen Knochenzellen ermöglicht wird (Noble 2008). Die nicht proliferierenden
Osteozyten entstehen aus Osteoblasten, die wiederum über Präosteoblasten aus Mesenchymalen
Stammzellen (siehe 3.1.2) differenzieren. Die Osteoblasten bauen den Knochen durch Sezernierung
von Matrixproteinen auf, die letztendlich mineralisieren. Die Matrix wiederum ist von sogenannten
3