Microbial Oxidation of Methane in Aquatic Systems Illuminated by Functional Metagenomics

216 Pages·2017·6.45 MB·English

by  Jon Graf

Microbial Oxidation of Methane in Aquatic Systems
Illuminated by Functional Metagenomics
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methane-oxidizing microorganisms. These microorganisms are pivotal in regulating
methane emissions from the oceans and freshwater systems and their study therefore Jon S. Graf
transcends scientific curiosity and is of global relevance to society as a whole. Despite their
importance, the knowledge about these microorganisms is restricted to cultured isolates
and little is known about the physiology of environmentally-relevant uncultured species.
Using culture-independent functional metagenomics in combination with physiological Dissertation zur Erlangung des Grades eines Doktors der Naturwissenschaften - Dr. rer. nat. -
experiments, this thesis aims to improve our understanding of the individual metabolic im Fachbereich Geowissenschaften der Universität Bremen
potential and activity that underlie the ecophysiology and environmental relevance of
several uncultured methane-oxidizing microorganisms.
Autor: Jon S. Graf
Universität Bremen
Max Planck Institut für Marine Mikrobiologie
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Bremen, Oktober 2017
Cover image: Epifluorescence microscopy image of cells involved in sulfate-depenent anaerobic oxidation of
methane after hybridization with specific rRNA-targeted oligonucleotide probes.

Microbial Oxidation of Methane in Aquatic
Systems Illuminated by Functional Metagenomics

Dissertation
zur Erlangung des Grades eines Doktors der Naturwissenschaften
- Dr. rer. nat. -
im Fachbereich Geowissenschaften der

Jon S. Graf
Bremen, Oktober 2017
Diese Arbeit wurde in der Zeit vom September 2012 bis Oktober 2017 im Rahmen
des Programms ‘The International Max Planck Research School of Marine
Microbiology‘ (MarMic) angefertigt. Die Ergebnisse dieser Arbeit wurden am Max
Planck Institut für Marine Mikrobiologie (Biogeochemie) erarbeitet.

Autor: Jon S. Graf
Universität Bremen
Max Planck Institut für Marine Mikrobiologie

Erstgutachter: Prof. Dr. Marcel M.M. Kuypers
Universität Bremen
Max Planck Institut für Marine Mikrobiologie

Zweitgutachter: Prof. Dr. Dr. h .c. Michael Wagner
Department für Mikrobiologie und Ökosystemforschung, Universität Wien

Datum des Promotionskolloquiums: 18. Januar 2018
Summary
Freshwater and marine environments are hotspots of methane cycling. Vast
amounts of methane, a potent greenhouse gas, are produced predominantly in the
sediments of these environments but very little eventually escapes to the atmosphere
due to the activity of methane-oxidizing microorganisms. These microorganisms are
pivotal in regulating methane emissions from the oceans and freshwater systems and
their study therefore transcends scientific curiosity and is of global relevance to society
as a whole. Despite their importance, the knowledge about these microorganisms is
restricted to cultured isolates and little is known about the physiology of
environmentally-relevant uncultured species. The aim of this study was to use culture-
independent functional metagenomics in combination with other physiological
experiments to study the individual metabolic potential and activity that underlie the
ecophysiology of several uncultured methane-oxidizing microorganisms.
The first study (Chapter 2) shows that uncultivated gamma-proteobacteria
related to Crenothrix are major methane consumers in two stratified Swiss lakes (Lake
Zug and Rotsee). Although Crenothrix bacteria have been infamous for infestation of
drinking water supplies for more than a century, little was known about their role in
methane cycling in the environment. This study provides first insights into the
metabolic potential and activity of Crenothrix and demonstrates their methane-
dependent growth under aerobic as well as under oxygen-deficient and denitrifying
conditions. Reconstruction of Crenothrix genomes allowed us to clarify the phylogenetic
assignment of their methane monooxygenase, an important classification marker for
methanotrophs, and revealed the metabolic potential for nitrate respiration to nitric or
even nitrous oxide. Overall these results suggest that Crenothrix can act as relevant
biological sink for methane in stratified lakes.
Chapter 3 focuses on methanotrophs of the candidate phylum NC10 in Lake Zug.
These bacteria form a relevant link between the methane and nitrogen cycle but
generally constitute only a minor part of the methanotrophic communities. We show
that NC10 bacteria, which couple methane oxidation to a unique O -producing
2
denitrification pathway, dominated the microbial community in the anoxic hypolimnion
of Lake Zug, comprising almost a third of the total bacterial population. This is the
hitherto highest reported abundance from any environment. We describe the
i
physiology and the habitat of this new species of the genus “Candidatus
Methylomirabilis”. The reconstructed genome of “Ca. Methylomirabilis limnetica”
confirmed its methane-oxidizing, denitrifying potential and revealed features, such as
formation of gas vesicles, previously not described for this genus. We could show that
“Ca. M. limnetica” was transcriptionally highly active in situ but the full biogeochemical
impact of NC10 bacteria has yet to be quantified.
In Chapters 4 and 5, the physiology and metabolic potential of an archaeal-
bacterial consortium involved in the sulfate-dependent anaerobic oxidation of methane
(S-AOM) was investigated using a highly active S-AOM enrichment culture. In contrast
to freshwater environments, this strictly anaerobic process is the dominant methane
sink in marine systems and controls the flux of methane to the atmosphere.
In Chapter 4 unravels the individual metabolic potential and activity of ANME-2c
archaea and SEEP-SRB1 bacteria using functional metagenomics in order to elucidate
the division of labor and interactions between these intertwined microorganisms. The
reconstructed genomes in conjunction with transcriptomic and proteomic data were
used to gather support for current hypotheses concerning the physiology of the two
microorganisms. We confirmed that ANME-2c encode, transcribe and express a
complete reverse methanogenesis pathway for methane oxidation and propose several
transcribed candidate genes, in particular two sulfite reductases, which might be
involved in a previously proposed archaeal dissimilatory sulfate reduction pathway.
Moreover we highlight the possibility of flavin-based electron bifurcation by soluble
heterodisulfide reductase as an important but overlooked aspect in the electron
transport chain of ANME. We confirm that SEEP-SRB1 express a complete canonical
sulfate reduction pathway, which arguably could also be involved in sulfur
disproportionation, and we also investigate the genomic potential for electron transfer
between ANME-2c and SEEP-SRB1.
Finally, Chapter 5 investigates a potential involvement of an S-AOM-associated
archaeal-bacterial consortium in the cycling of inorganic phosphate. We demonstrate
that the S-AOM microorganisms appear to utilize phosphate beyond assimilatory
uptake and observed an enigmatic shuffling of phosphate between soluble and
particulate fractions that was only active when methane was oxidized. These laboratory
results highlight an intriguing yet unresolved involvement of phosphate in S-AOM that
remains to be verified in situ.
ii
Zusammenfassung
Süsswassersysteme und Ozeane sind durch intensive Methanzyklen geprägt.
Obwohl grosse Mengen an Methan in den Sedimenten produziert werden, entweicht
jedoch nur sehr wenig von diesem potenten Treibhausgas in die Atmosphäre.
Hauptverantwortlich dafür sind Methan-oxidierende Mikroorganismen, welche eine
entscheidende Rolle in der Regulierung von Methanemissionen spielen. Die Studie
dieser Mikroorganismen erstreckt sich somit über die wissenschaftliche Neugier hinaus
und ist für die Gesellschaft von grosser Bedeutung. Trotz ihrer Wichtigkeit ist das Wissen
über diese Mikroorganismen auf kultivierte Isolate beschränkt und es ist wenig über die
Physiologie von unkultivierten aber umweltrelevanten Spezies bekannt. Ziel dieser
Studie war es, das individuelle Stoffwechselpotential und die Aktivität dieser
unkultivierten Mikroorganismen mittels kulturunabhängiger, funktioneller
Metagenomik in Kombination mit physiologischen Experimenten zu untersuchen.
In der ersten Studie (Kapitel 2) wird gezeigt, dass unkultivierte Crenothrix-
Bakterien, welche den Gamma-Proteobakterien angehören, zu den wichtigsten Methan-
Konsumenten in zwei geschichteten Schweizer Seen (Zug und Rotsee) zählen. Obwohl
Crenothrix-Bakterien seit mehr als einem Jahrhundert für den Befall von
Trinkwasserversorgungssystemen bekannt sind, ist ihre Rolle im ökologischen
Methanzyklus weitestgehend nicht verstanden. Diese Studie liefert auch erste Einblicke
in das metabolische Potenzial und die Aktivität von Crenothrix und hebt ihr
methanabhängiges Wachstum unter aeroben sowie unter sauerstoffarmen und
denitrifizierenden Bedingungen hervor. Die Rekonstruktion von Crenothrix-Genomen
ermöglichte es erstmals, die phylogenetische Zuordnung der Methanmonooxygenase,
einem wichtigen phylogenetischen Marker für methanotrophe Bakterien, aufzuklären
und zeigte das metabolische Potenzial für Nitratatmung zu Stickstoffmonoxid oder
Distickstoffmonoxid auf. Insgesamt deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass Crenothrix-
Bakterien als wichtige biologische Senke für Methan in geschichteten Seen fungieren.
In Kapitel 3 wurden Bakterien des Kandidaten-Phylum NC10 im Zugersee
untersucht. Diese Bakterien sind aufgrund ihrer Fähigkeit, Methan- und Stickstoffzyklen
zu verknüpfen, von Bedeutung, jedoch bilden NC10-Bakterien in der Regel nur einen
kleinen Teil der methanotrophen Gemeinschaft. Wir zeigen, dass NC10-Bakterien,
welche Methan-Oxidation mit einem einzigartigen O -produzierenden Denitrifikations-
2
Stoffwechselweg verbinden, die mikrobielle Gemeinschaft im anoxischen Hypolimnion
des Zugersees dominierten und fast ein Drittel der gesamten Bakterienpopulation
umfassten. Dies ist die bislang höchste Abundanz von NC10-Bakterien, die je in der
Umwelt beschrieben wurde und erlaubte die erste Charakterisierung der Physiologie
und dem Habitat dieser neuen Spezies der Gattung "Candidatus Methylomirabilis". Das
iii
rekonstruierte Genom von "Ca. Methylomirabilis limnetica" bestätigte das Potential zur
Methanoxidation und Denitrifikation und zeigte für diese Gattung neuartige Merkmale,
wie zum Beispiel Gasvesikelgene, welche wahrscheinlich eine Adaption an das
planktonische Habitat darstellen. Obwohl die hohe in situ Aktivität von "Ca. M.
limnetica" transkriptionell nachgewiesen werden konnte, muss die biogeochemische
Bedeutung der NC10-Bakterien erst noch quantifiziert werden.
In den Kapiteln 4 und 5 wurde das physiologische und metabolische Potential
eines Archaeen-Bakterien-Konsortiums in einer hochaktiven Anreicherungskultur
untersucht, welches an der sulfatabhängigen anaeroben Oxidation von Methan (S-
AOM) beteiligt ist. Im Gegensatz zu Süsswassersystemen ist dieser streng anaerobe
Prozess die dominierende Methan-Senke in marinen Systemen und kontrolliert den
Fluss von Methan in die Atmosphäre.
In Kapitel 4 entschlüsseln wir das individuelle metabolische Potential und die
Aktivität von ANME-2c-Archaeen und SEEP-SRB1-Bakterien mit funktionellen
metagenomischen Methoden, um die metabolische Arbeitsteilung und die
Wechselwirkung zwischen diesen Mikroorganismen zu untersuchen. Die
rekonstruierten Genome und transkriptomischen sowie proteomischen Daten wurden
verwendet, um aktuelle Hypothesen über die Physiologie der beiden Mikroorganismen
zu bestätigten. Unsere Untersuchungen zeigten, dass ANME-2c einen vollständigen
Reverse-Methanogenese-Stoffwechselweg zur Methanoxidation exprimierten. Zudem
wurden mehrere transkribierte Kandidatengene identifiziert, insbesondere zwei Sulfit-
Reduktasen, die an dem zuvor vorgeschlagenen archaealen, dissimilatorischen
Stoffwechselweg zur Sulfatreduktion beteiligt sein könnten. Darüber hinaus stellen wir
die Möglichkeit einer Flavin-basierten Elektronen-Bifurkation durch lösliche
Heterodisulfid-Reduktase als wichtiger und zuvor übersehener Aspekt in der
Elektronentransportkette von ANME heraus. Wir zeigen, dass SEEP-SRB1-Bakterien einen
vollständigen Stoffwechselweg zur Sulfatreduktion exprimieren, der auch an Schwefel-
Disproportionierung beteiligt sein könnte. Darüber hinaus wurde das genomische
Potential für den Elektronentransfer zwischen ANME-2c und SEEP-SRB1 untersucht.
Schließlich wurde in Kapitel 5 eine mögliche Beteiligung eines S-AOM-
assoziierten Konsortiums am Zyklus von anorganischem Phosphat betrachtet. Die S-
AOM-Mikroorganismen scheinen Phosphat jenseits des assimilatorischen Bedarfs zu
nutzen, da eine rätselhafte Umschichtung von Phosphate zwischen löslicher und
partikulärer Phase beobachtet wurde. Diese Umschichtungen waren nur aktiv, wenn
Methan oxidiert wurde. Diese Laborergebnisse zeigen eine faszinierende, aber noch
ungelöste Beteiligung von Phosphat am S-AOM-Prozess, die aber in situ noch verifiziert
werden muss.

iv
Contents

Summary i

Zusammenfassung iii

Chapter 1 1
General Introduction 1
Aims and Outline 21

Chapter 2 37
Crenothrix are major methane consumers in stratified lakes

Chapter 3 57
Bloom of a denitrifying methanotroph, “Candidatus Methylomirabilis
limnetica”, in a deep stratified lake

Chapter 4 93
Physiology of microorganisms mediating sulfate-dependent anaerobic
oxidation of methane illuminated by functional metagenomics

Chapter 5 145
Cycling of phosphate associated with microorganisms involved in the sulfate-
dependent anaerobic oxidation of methane

Chapter 6 167
Conclusions and Outlook

Acknowledgements 182

Appendix A 184
Contributions to other studies